《NAR Cancer》：Targeted CRISPR knockout screening identifies known and novel chemogenomic interactions between DNA damaging agents and DNA repair genes
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本研究针对DNA损伤剂(DDA)与DNA损伤修复(DDR)通路间复杂的化学基因组互作网络尚未完全阐明的现状，开发了靶向353个DDR基因的CRISPR敲除筛选平台。研究人员在LN229胶质瘤细胞中系统评估了15种DDA的修复依赖性，不仅验证了已知互作（如FA通路修复ICL、MMR缺失导致甲基化剂耐药），更发现了新机制：TC-NER特异性修复单功能烷化剂加合物、FA通路参与甲基损伤修复、TOP1与TOP2抑制剂引发差异DSB修复路径，以及结构细微差异的咪唑四嗪类化合物（KL-50 vs TMZ）呈现迥异的BRIP1/FANCJ依赖性。该研究为理解DDA作用机制及肿瘤精准治疗提供了重要资源。
在肿瘤治疗领域，DNA损伤药物始终是化疗方案的基石。然而，这些药物在杀伤癌细胞的同时，也会对正常细胞造成无差别攻击，导致严重的毒副作用。其核心挑战在于，我们对于不同DNA损伤剂如何与细胞内庞大的DNA损伤修复网络相互作用，仍缺乏系统性的全景式认知。传统的生化与遗传学方法虽能解析单一通路，却无法高效捕捉不同损伤剂与数百个修复基因之间错综复杂的互作关系。这种知识的空白，直接限制了我们在临床上根据肿瘤特有的基因突变背景来精准选择化疗方案的能力。试想，如果能够清晰绘制出一幅“DNA损伤剂-修复基因”相互作用图谱，医生便有可能像“按图索骥”般，为DNA修复通路存在特定缺陷的肿瘤患者匹配最敏感的化疗药物，从而在提高疗效的同时降低毒性。这项发表于《NAR Cancer》的研究，正是致力于绘制这幅关键图谱。
研究人员开发了一个创新的靶向DNA损伤修复基因的CRISPR敲除筛选平台。该平台的核心是一个精心设计的sgRNA文库，靶向353个经过严格筛选的DDR基因。利用此平台，他们在LN229人胶质瘤细胞系（具有野生型TP53背景）中，对15种代表不同作用机制的DNA损伤剂进行了大规模并行筛选，累计评估了5295种潜在的DDR相关化学基因组相互作用。筛选过程中，细胞经过长达12天的药物处理（共4次给药），随后通过高通量测序分析sgRNA的丰度变化，并使用MAGeCK-RRA算法鉴定导致药物敏感性（负选择）或耐药性（正选择）的基因敲除。
系统水平分析揭示DDA类别特异的修复依赖性
通过基因和通路水平的聚类分析，研究发现不同类别的DDA呈现出独特的“遗传指纹”。单功能烷化剂（如Illudin S、黄曲霉毒素B1）的敏感性主要由转录偶联核苷酸切除修复(TC-NER)基因的缺失驱动，而全局基因组核苷酸切除修复(GG-NER)基因则非必需。甲基化剂（TMZ, MMS）和双功能烷化剂（顺铂、丝裂霉素C等）均显示出对范可尼贫血(FA)通路和同源重组(HR)基因的强烈依赖性，同时甲基化剂处理中，错配修复(MMR)基因的缺失导致显著的耐药性。拓扑异构酶抑制剂中，拓扑异构酶II抑制剂依托泊苷的敏感性高度依赖于经典非同源末端连接(EJ)通路基因，而拓扑异构酶I抑制剂拓扑替康则更依赖于HR和复制叉稳定性相关基因，而非EJ通路。
BRIP1/FANCJ是KL-50特异性敏感因子
研究团队对结构高度相似的咪唑四嗪类化合物（TMZ、米托唑胺MTZ、KL-50）进行了精细比较。尽管TMZ与KL-50均依赖FA/HR通路致敏，但筛选结果揭示了关键差异：MMR基因缺失仅对TMZ产生耐药，而对KL-50无影响，证实了KL-50通过形成链间交联(ICL)绕过MMR的机制。更重要的是，他们发现解旋酶BRIP1（亦称FANCJ）的敲除特异性地显著增强细胞对KL-50以及其他双功能交联剂（如顺铂）的敏感性，但对TMZ的敏感性影响甚微。这一发现通过在不同细胞系（LN229, RPE-1, U2OS）中进行的生长抑制实验和克隆形成实验得到了严格验证，表明BRIP1在ICL特异性修复中扮演着独特而关键的角色，不同于其他FA核心蛋白（如FANCA, FANCD2）对TMZ和KL-50均有广泛敏感性。
本研究成功构建并应用了一个高效、高内涵的靶向DDR CRISPR筛选平台，系统性地描绘了多种重要DNA损伤剂与DNA修复网络之间的化学基因组相互作用图谱。研究不仅验证了众多已知的相互作用，更重要的是发现了若干此前未被充分认识的新机制，例如FA通路在甲基化损伤应答中的角色，以及TOP1与TOP2抑制剂引发的截然不同的双链断裂修复路径偏好。特别是对KL-50特异性依赖BRIP1/FANCJ的发现，为理解该类药物的作用机制和潜在的生物标志物提供了新视角。这些研究成果极大地丰富了我们对DNA损伤修复生物学的基本认识，并为未来在肿瘤精准治疗中，依据肿瘤的DDR基因缺陷谱合理选择化疗药物或联合治疗策略，提供了宝贵的理论依据和数据资源。
