《ACS Nano》：Quantitative Mapping of the Lipid Nanoenvironment around Transmembrane Proteins in Living Cells
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这篇研究通过创新的蛋白质微图案化技术，首次在活细胞质膜中定量揭示了跨膜蛋白对其周围脂质纳米环境流动性的影响。研究发现，大多数被测蛋白（β2-AR、HA-WT、HA-Δpalm）并未形成紧密结合的“边界脂质”层，挑战了其作为普遍膜组织原则的观点。该工作为理解脂质-蛋白质相互作用提供了直接实验证据，方法学（TIRFM、单分子追踪）具有重要参考价值。
引言：探索质膜组织的微观世界
质膜的功能和组织是由数千种不同蛋白质和脂质之间动态而复杂的相互作用所介导的。脂质在质膜组织中扮演着多样化的角色：作为膜的构建模块，它们为跨膜蛋白提供了基质，并共同创造了一个具有特定横向压力分布、膜厚度和电荷分布等特征的膜环境，从而塑造蛋白质的功能。除了这种整体性的基质作用，个别脂质也通过特异性结合来调节蛋白质的构象和功能，其亲和力在某些情况下甚至允许脂质与蛋白质共结晶。介于这两个极端之间的，是大量具有广泛特异性和亲和力的脂质-蛋白质相互作用，它们被提议协同作用，为每个跨膜蛋白创造一个独特的脂质纳米环境，从而促进其最佳功能。然而，是否所有跨膜蛋白都具有这样的纳米环境，以及这些环境的性质如何，在很大程度上仍是未知的。
设想一个特定的跨膜蛋白，与蛋白质表面直接接触的脂质，其特性似乎很可能不同于本体脂质或与不同蛋白接触的脂质。蛋白质的特定结构，包括其带电残基的分布、表面积和粗糙度、跨膜区域的长度和/或相对于膜法线的倾斜度，可能有利于特定脂质种类的结合而排除其他种类，同时也可能影响那些与蛋白质表面直接接触的脂质的性质（例如，链序、堆积参数、倾斜度）。基于在重建的脂质/蛋白质系统中进行的电子自旋共振（ESR）实验，几十年前就提出了跨膜蛋白周围存在“边界”或“环状”脂质的概念，这些实验揭示了一个流动性较低的脂质亚群。事实上，天然质谱已经鉴定出许多蛋白质在不同选择性水平上与脂质的结合。除了调节蛋白质功能外，这些紧密结合的脂质可能反过来塑造跨膜蛋白周围的脂质纳米环境。一个更以脂质为中心的脂质纳米环境概念由脂筏假说引入，该假说假定依赖固醇的、具有更高粘度和有序性的纳米级膜域对蛋白质进行区室化。根据这种观点，蛋白质会根据其脂筏亲和力，被或多或少有序的脂质纳米环境所包围，甚至可能响应于构象或寡聚状态的变化而调节其纳米环境，从而影响蛋白质功能。另一方面，信号传导事件中发生的蛋白质重组可能会改变脂质纳米环境，进而影响信号响应。
当试图研究跨膜蛋白的脂质纳米环境时，研究人员面临一个难题：诸如天然质谱、晶体学和电子自旋共振（ESR）等技术可以在确定的模型系统中发挥强大作用，但它们始终存在一个局限性，即无法在复杂的天然、生命系统中探测脂质/蛋白质相互作用——即使可以，也只能获得间接信息且数据解读困难。即使是最先进的成像技术也缺乏探测原位瞬时相互作用的空间和时间分辨率。分子动力学模拟已经识别出钾离子通道Kv1.2周围有一个紧密相关的环状脂质环，该环甚至从蛋白质表面延伸出几纳米，但对于其他蛋白质检测到的影响则要小得多。最终，分子动力学模拟的结果取决于力场的选择，并受到可访问时间尺度和系统复杂性的限制。
结果
示踪脂质在微图案化细胞中的扩散
本研究采用先前开发的蛋白质微图案化分析方法，在活细胞质膜中探测不同跨膜蛋白的纳米环境。该分析方法的原理是，固定的障碍物会以特征性的方式降低示踪分子的扩散能力，从而能够推断障碍物的大小。重要的是，它不需要高分辨率地追踪单个示踪分子，而是依赖于测量平均扩散常数。该分析的精度关键取决于能否稳健地确定由固定障碍物引起的示踪分子扩散性的倍数降低，这只能通过在同一细胞中进行有和没有固定障碍物的测量来实现。为此，研究人员将感兴趣的蛋白质（POI）在活细胞的质膜特定区域（“ON”区域）直接富集并固定，而其他区域则缺乏该蛋白质（“OFF”区域）。在ON区域扩散的脂质示踪分子会将固定的POI分子视为其随机行走的障碍物，从而根据POI的表面密度和大小降低其扩散迁移率。此外，POI周围特异性的、共同固定的脂质纳米环境可以通过三种方式影响示踪剂的扩散：示踪剂完全不受影响；示踪剂被排除在紧密结合的脂质壳之外；示踪剂可以进入纳米环境，在那里其扩散速度减慢甚至与POI发生瞬时共固定。在情况（ii）和（iii）下，实验将产生一个比POI空间尺寸更大的表观POI尺寸。
使用软光刻技术制备了具有规则抗GFP抗体图案（3微米大小的点）的微结构玻璃盖玻片。表达mGFP标记的POI的HeLa细胞在活细胞质膜中根据抗体图案显示出特异性的POI富集和固定。ON区域内固定的POI密度（ρPOI）通过GFP抗体密度和POI表达水平进行调整。研究人员选择了不同跨膜蛋白类别的代表进行实验：β2-肾上腺素能受体（β2-AR，一种具有7个跨膜螺旋和N端mGFP的GPCR）；推定的六聚体钙通道Orai1（包含4个跨膜螺旋，在扩展的环3中带有mGFP）；基于流感病毒血凝素的单次跨膜蛋白构建体（HA-WT）及其棕榈酰化缺陷突变体（HA-Δpalm）。作为示踪脂质，选择了荧光团标记的鞘磷脂（SM-Atto594），其中短的非乙二醇连接臂减少了荧光团在膜界面区域的分配并防止脂质翻转到双分子层的胞内侧。研究人员将质膜与SM-Atto594掺杂，使其密度允许区分分离良好的单分子信号，并使用全内反射荧光显微镜（TIRFM）测定其扩散迁移率。通过分析，使用从GFP通道记录的POI图案图像导出的选择掩膜，将单分子轨迹分类为“ON”和“OFF”。分别汇集每个细胞ON和OFF区域的轨迹，并通过拟合前两个滞后时间点，从均方位移（MSD）确定扩散系数DON和DOFF。通常，在高达约50-100毫秒的滞后时间下，ON和OFF区域的示踪剂迁移率都能很好地用布朗运动描述；在更长的滞后时间下，应用选择掩膜会引入人为的限制，导致表现出亚扩散行为。研究人员确认微图案化或应用选择掩膜本身不会对测量的扩散系数产生意外影响。
接下来，通过将ON区域的整体亮度与单个mGFP分子的亮度相关联，确定了固定的mGFP标记的POI的表面密度ρmGFP，并将相对迁移率DON/DOFF绘制为ρmGFP的函数。正如预期和先前观察到的那样，对于所有图案化的蛋白质，DON/DOFF随着ρmGFP的增加而降低。
从示踪脂质扩散确定蛋白质尺寸
固定的蛋白质作为示踪分子扩散的空间障碍。在没有其他相互作用的情况下，示踪剂的扩散与随机固定的圆形障碍物的密度ρ及其大小相关，关系式为：DON/DOFF= (1 - (1 - e-ρR2π)/CP)，其中CP是渗透阈值，即示踪剂扩散的长程传导路径消失且扩散系数接近零时的障碍物密度。在该模型中，示踪剂和障碍物的半径被简化为一个组合半径R。将障碍物建模为重叠圆盘时，渗透阈值处的障碍物覆盖面积与障碍物大小无关，约为CP≈ 0.676。
研究人员先前进行了示踪剂在固定障碍物和共同固定的纳米环境区域中扩散的蒙特卡洛模拟，并评估了不同纳米环境尺寸和扩散性的影响。基于此，他们开发了一个经验模型，描述了存在惰性空间障碍物和共同固定的纳米环境时的示踪剂迁移率比值DON/DOFF。模拟表明，在实验时间尺度和障碍物密度下，图1B所示的三种情景对DON/DOFF的影响在性质上相似；脂质纳米环境的存在只会被检测为增大的POI平面内半径。因此，研究人员使用惰性圆形障碍物模型（公式1）来拟合实验数据。为此，对测量的密度ρGFP进行了校正，以考虑GFP成熟不完全和蛋白质的寡聚状态。应用公式1得到了实验确定的表观半径Rapp，该半径也包括了脂质示踪剂的大小Rlipid。基于SAXS/SANS数据确定的C18-SM的每个脂质面积（0.625 nm2）并考虑头基区域庞大的三唑部分，研究人员估计SM-Atto594的示踪剂半径为Rlipid= 0.49 ± 0.05 nm。从Rapp中减去示踪剂大小Rlipid，得到表观的蛋白质平面内半径RPOI,app= Rapp– Rlipid，该半径包含了蛋白质的空间尺寸及其膜纳米环境的潜在贡献。
表观蛋白质尺寸与蛋白质结构的比较
为了评估实验确定的RPOI,app数据，研究人员首先考虑了可用的蛋白质结构信息，以获得示踪剂可能遇到的蛋白质障碍物空间尺寸的合理估计。从β2-AR最近的NMR结构中，提取了外膜叶中所有原子的位置，并确定了围绕其z投影的凸包横截面积。由此推导出具有相同面积的假设圆形障碍物的平面内半径RPOI= 1.94 nm。β2-AR可能在质膜上形成功能性同源二聚体；基于一个表明由胆固醇桥接的二聚体的晶体结构，确定二聚体半径RPOI= 3.13 nm。这种情况下横截面积的长宽比约为2:1，这仍然处于障碍物形状对CP影响较小的范围内，可以忽略不计。
虽然尚无人类Orai1的晶体结构，但其果蝇同源物已作为六聚体被结晶。使用与β2-AR相同的方法，获得六聚体半径RPOI= 3.16 nm。对于HA-WT和HA-Δpalm，基于AlphaFold2预测的跨膜螺旋3D结构计算了蛋白质半径，并通过PPM 3.0计算了其在膜中的方向。
图3显示了实验推导的表观蛋白质半径与从结构数据中提取的相应半径的比较。对于β2-AR，无论假设是单体还是二聚体结构，测量的半径与从结构数据估计的半径都非常吻合。Orai1的实验数据得出的尺寸略大于预测值（3.54 ± 0.28 nm 对 3.16 nm）。HA-WT和HA-Δpalm的测量尺寸相当（分别为1.37 ± 0.09 nm和1.25 ± 0.11 nm），但也略大于结构预测的预期值（1.06 nm）。总之，实验确定的POI半径通常与从结构数据中提取的半径相似。
蛋白质相关脂质纳米环境的可能特征
到目前为止，研究人员将POI视为对脂质示踪剂不可渗透的障碍物。然而，很可能存在POI相关的脂质纳米环境，允许示踪剂进入但仅降低其在该区域的扩散性（图1B中的情景iii）。因此，研究人员感兴趣的是，这类具有降低扩散性的假定纳米环境（NERDs）的存在将如何在实验中被检测到。为了研究这一点，他们利用了先前开发的描述存在惰性空间障碍物和共同固定的NERDs时示踪剂迁移率的经验模型（公式3）。在该模型中，假设半径为RPOI的圆形POI被一个宽度为dNERD的环状脂质纳米环境所包围。在NERD内，示踪剂的迁移率相对于本体膜区域降低了一个因子fNERD。
显然，不同的dNERD和fNERD组合会导致DON/DOFF对ρPOI产生相同的依赖性。例如，较大的dNERD值结合较小的迁移率降低fNERD，其影响方式可能与较小的dNERD值结合较大的迁移率降低相似。因此，研究人员感兴趣的是，哪些dNERD和fNERD的组合与他们的实验数据一致。
为此，他们探索了133种不同的dNERD和fNERD组合。对于每种组合，预测了DON/DOFF对POI密度ρPOI的依赖性，并以与处理实验数据集完全相同的方式分析这些计算机生成的数据集：将每个数据集拟合到公式1，并考虑脂质大小，得到不同NERD尺寸和扩散性的RPOI,app值。接下来，将实验确定的RPOI,app值与模拟值进行比较，以识别与数据一致的NERD特征（在图4B–F中用绿色表示）以及可以排除的特征（用红色表示）。对于β2-AR、HA-WT和HA-Δpalm，他们的数据与dNERD= 0.7 nm（单层脂质）且迁移率相对于本体膜区域适度降低（fNERD≥ 0.5）的NERDs一致，也与dNERD≤ 1.4 nm且迁移率降低小于30%的NERDs一致。他们的数据允许排除即使存在单层脂质包围蛋白质核心且扩散性降低90%（fNERD≤ 0.1）的情况。对于Orai1，参数空间更大；dNERD高达2.1 nm（约3层脂质）且扩散性降低50%的NERD与数据一致，高达2层脂质且扩散性降低85%的情况也与数据一致。
讨论
众所周知，跨膜蛋白对其附近脂质的动力学、构象和组织施加影响。然而，除了数量有限的特征明确的特异性脂质相互作用外，这种影响的程度在很大程度上是未知的。讨论的概念包括围绕跨膜蛋白富集特定脂质种类以介导功能，以及紧密结合的、与蛋白质共扩散的脂质壳。尽管在模拟中经常观察到，但验证这些概念的实验证据很少且难以获得。通过利用蛋白质微图案化方法，本研究填补了这一空白，提出了一个针对质膜组织这一基本方面的简单问题：跨膜蛋白如何影响其直接脂质纳米环境的流动性？
研究人员选择了来自四个不同类别的蛋白质，这些蛋白质已被报道具有各种或多或少的特异性脂质相互作用，其基本原理是这些差异也可能影响它们独特的脂质纳米环境。β2-AR与胆固醇的相互作用有充分记录：胆固醇已被共结晶，被认为可改变蛋白质的结构特性，并已鉴定出三个特异性结合位点用于其活性的变构调节。对于本研究中使用的截短HA变体，一项荧光寿命显微镜-福斯特共振能量转移（FLIM-FRET）研究发现其与GPI-CFP存在棕榈酰化依赖性共聚集，这被解释为 partitioning into membrane rafts。棕榈酰化由于连接了饱和酰基链而增加了蛋白质的疏水性，并且棕榈酰化蛋白质经常在相分离模型系统和抗去垢剂膜（DRMs）中被发现 partitioning to ordered phases。Orai1可以被棕榈酰化并结合胆固醇，这两者都被证明可以调节其功能。
在本分析方法中，研究人员使用在存在固定POI的特定密度下示踪剂迁移率的降低作为确定示踪剂所经历的蛋白质障碍物大小的读出参数。总的来说，活细胞质膜中的蛋白质大小与从可用结构数据推导出的结果非常吻合。具体来说，对于所有被检测的蛋白质，研究人员均未检测到对SM-Atto594示踪剂不可渗透的紧密结合的脂质壳，否则这将表现为半径增加约0.7 nm。
利用先前开发的经验模型，研究人员系统地绘制了可能与蛋白质相关的脂质纳米环境的参数空间，重点关注其大小和对扩散性的影响。虽然他们无法提供所研究蛋白质周围纳米环境的明确表征，但他们的分析能够为潜在情景建立边界。如果假设只有与蛋白质直接接触的第一层脂质受到影响（即dNERD= 0.7 nm），那么数据支持的最大可能效应是将该脂质壳内的脂质迁移率（图4中的fNERD）分别降低至β2-AR、Orai1、HA-WT和HA-Δpalm的50%、5%、25%和40%。将结果与脂质双层中蛋白质扩散的计算机模拟进行比较。Niemel?等人使用原子分子动力学模拟研究电压门控离子通道Kv1.2对其脂质纳米环境的影响。在该研究中，作者描述了与蛋白质表面直接接触的脂质迁移率降低了15倍，此外，对相邻脂质层也有显著影响，大约50-100个脂质（相当于2-3层）与离子通道一起移动。在实验设置中，这种情况将表现为脂质的共固定，被检测为至少dNERD= 0.7 nm（单层脂质）且迁移率降低fNERD< 0.06的纳米环境。这种效应远大于实验中通常观察到的；只有Orai1的数据与之相符。
与蛋白质直接接触的脂质迁移率降低的程度似乎确实取决于跨膜结构域的具体特征。具有高度不规则表面的蛋白质，如Kv1.2通道，可能促进脂质的更紧密结合。事实上，对12次跨膜螺旋蛋白LacY、WALP23二聚体和单次跨膜的转铁蛋白受体的分子动力学模拟揭示了蛋白质附近脂质迁移率在性质上相似但略小的影响。
Orai1在本研究中扮演了一个独特的角色。由于其六聚体状态，研究人员无法像其他POI那样实现较高的图案化蛋白质表面密度，导致表观半径的误差较大。这导致了Orai1观察到的更大NERD参数空间——实验数据与存在高达两层紧密结合的脂质（迁移率降低至15%）的情况一致。然而，这并不能解释实验提取的尺寸与晶体结构提取的尺寸之间的差异（R = 3.54 nm 对 R = 3.16 nm）。请注意，为了从晶体结构估计大小，仅考虑了位于胞外叶的蛋白质和脂质部分。这种简化通常是合理的，因为所有POI的胞外部分都小于或等于跨膜区域。然而，融合蛋白中mGFP的贡献可能是相关的，特别是在Orai1的情况下。Orai1六聚体可以通过多达六个mGFP分子连接到图案化的抗体上，导致细胞外膜近端区域的大小为R = 4.9 nm（假设mGFP垂直取向），这明显大于跨膜区域（R = 3.16 nm）。因此，不能排除脂质示踪剂上的荧光团与Orai1结合的mGFP之间的空间阻碍和/或相互作用对实验确定的大小有贡献，从而导致对Orai1脂质结合程度的高估。原则上，这也适用于β2-AR、HA-WT和HA-Δpalm，尽管在这些情况下胞外部份和/或mGFP的可能贡献较小。
由于脂质示踪剂专门探测胞外叶，仅存在于胞质叶的NERD将无法在分析中被检测到。这可能特别适用于β2-AR，已有报道称其受到阴离子磷脂的变构调节。此外，由于棕榈酰化导致的HA-WT尺寸增加，和/或围绕HA-WT的、不延伸到胞外叶的更具粘性的纳米环境，将不会被记录。
在文献中，纳米环境的脂质通常被称为“不同于本体脂质”。考虑到质膜中蛋白质的丰度（占其质量的50%，每μm2约30,000个蛋白质，约占总面积的15%），这种“本体”或“自由”脂质的存在受到质疑。假设所有脂质的扩散都受到蛋白质的影响，并且质膜仅由纳米环境组成——这将如何影响结果？固定障碍物对示踪剂扩散的影响远大于移动障碍物。通过微图案化感兴趣的蛋白质，可以将其通过固定化分离出来，同时分离出其特定的纳米环境。由于大多数质膜蛋白是移动的，OFF区域的脂质示踪剂将在不同的（移动和固定的）纳米环境之间移动，扩散系数为DOFF。在ON区域内，它还会遇到高密度的固定化POI（及其纳米环境），这对示踪剂扩散有主导影响。因此，即使质膜中没有本体脂质，与固定化POI相关的边界脂质也会在分析中被检测到。
结论
总之，数据表明跨膜蛋白周围环状脂质的紧密结合并非质膜组织的普遍原则。请注意，这一发现适用于静息、未受刺激的细胞；膜能量景观的微小变化可能足以克服脂质-蛋白质结合的熵罚。例如，通过受体介导的信号传导诱导的蛋白质聚集，可能引发或稳定蛋白质周围的脂质纳米环境。这可能与胞质叶发生的事件交织在一起或起源于胞质叶，通过蛋白质和脂质之间的电荷相互作用、胞质中近膜的液-液相分离和/或与皮层肌动蛋白细胞骨架的耦合而发生。
