益生菌Lacticaseibacillus paracasei中Chb与nag基因簇介导N,N'-二乙酰壳二糖代谢的机制与调控研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Chb and nag genes drive N,N′-diacetylchitobiose metabolism in probiotic Lacticaseibacillus paracasei

本研究针对益生菌在肠道环境中利用宿主来源糖胺聚糖的适应性机制，系统解析了Lacticaseibacillus paracasei BL23代谢N,N'-二乙酰壳二糖（ChbNAc）的遗传基础与调控网络。研究发现，chb基因簇编码的细胞二糖型磷酸转移酶系统（PTSChb）和GH170家族糖苷水解酶ChbE协同介导ChbNAc的摄取与磷酸化水解，而nagA编码的N-乙酰葡萄糖胺-6P脱乙酰酶是代谢通路的关键节点。通过转录调控实验和蛋白-DNA互作分析，首次揭示ChbR和NagR分别抑制chb和nagAR簇的表达，且共同调控nagB（葡萄糖胺-6P脱氨酶），形成多层级调控网络。该工作为益生菌肠道定植的糖利用策略提供了新视角，发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》。

　　

在人类肠道这个微生物竞相争夺资源的战场上，益生菌如何脱颖而出？它们的生存秘诀之一，或许是能够高效利用宿主和食物中那些结构特殊的糖分子。N,N'-二乙酰壳二糖（ChbNAc）正是这样一种关键资源：它不仅是糖蛋白N-糖基化核心结构的组成部分，广泛存在于母乳和肠道黏液层中，也是自然界最丰富的多糖之一——几丁质的主要降解产物。对于像Lacticaseibacillus paracasei（副干酪乳杆菌）这样广泛应用于益生菌制剂的细菌来说，解锁ChbNAc的代谢能力，意味着在竞争激烈的肠道环境中获得了一份额外的“能量套餐”，从而更好地定植并发挥益生功能。然而，在乳酸杆菌目（Lactobacillales）细菌中，这一代谢路径的遗传基础和调控机制长期以来是一片未知的疆域。

为了解决这一问题，由Victor Garcia-Telles等人组成的研究团队，以益生菌株Lacticaseibacillus paracasei BL23为模型，展开了一项深入探索。他们的研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上，首次系统揭示了该菌株代谢ChbNAc的完整通路及其精细的转录调控网络。

为开展本研究，作者主要应用了几项关键技术：通过构建基因敲除突变体（如chbC, chbE, chbD, nagA, chbR, nagR等）并结合表型分析（生长曲线和碳水化合物消耗检测），验证了特定基因的功能；利用逆转录定量PCR（RT-qPCR）技术分析了chb和nag基因簇在不同碳源条件下的转录水平变化；通过蛋白纯化技术获得组氨酸标签标记的ChbR和NagR蛋白，并采用凝胶阻滞或电泳迁移率实验（EMSA）证实了这些转录调控因子与靶基因启动子区域的直接结合作用；运用生物信息学工具对基因簇的保守性和调控元件进行了分析。

研究结果

L. paracasei BL23通过细胞二糖型PTS^Chb利用ChbNAc和TriChbNAc

研究人员发现L. paracasei BL23能够以ChbNAc及其三聚体形式TriChbNAc作为唯一碳源生长，但不能利用四聚体TetraChbNAc或去乙酰化的壳二糖。通过基因组比对和突变体构建，他们鉴定出一个名为chb的基因簇，其中chbC、chbB、chbA编码一个细胞二糖型磷酸烯醇式丙酮酸依赖的糖磷酸转移酶系统（PTS）的IIC、IIB和IIA组件。chbC基因失活后，菌株完全丧失在ChbNAc和TriChbNAc上的生长能力，证明PTS^Chb负责这两种寡糖的摄取和磷酸化。

chbE和chbD基因在ChbNAc代谢中的作用

位于chbC下游的chbE基因，其产物与金黄色葡萄球菌的MupG蛋白（属于新定义的GH170家族糖基水解酶）同源。chbE突变体无法在ChbNAc上生长，表明ChbE作为一种推测的磷酸-β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶，负责水解磷酸化的ChbNAc（ChbNAc-P）。另一个基因chbD编码一个含DUF3284结构域的功能未知蛋白。chbD缺失突变体在利用ChbNAc时表现出延长的滞后期，但最终能达到与野生型相似的菌液密度，残留糖分析证实其消耗ChbNAc的速度减慢，提示ChbD在优化ChbNAc利用效率中扮演辅助角色。

nagA基因是ChbNAc代谢通路的关键环节

ChbNAc-P经ChbE水解后，预计产生N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰葡萄糖胺-6磷酸（GlcNAc-6P）。之前已知的nagA突变体（编码GlcNAc-6P脱乙酰酶）不能在GlcNAc上生长，本研究发现该突变体同样不能利用ChbNAc。这证实了NagA催化的脱乙酰反应（生成葡萄糖胺-6P）是ChbNAc代谢必经步骤。未能成功构建nagB（编码葡萄糖胺-6P脱氨酶，催化产物进入糖酵解）突变体，暗示该基因可能对菌体生存至关重要。

chb和nag基因的转录调控机制

RT-qPCR分析显示，ChbNAc能强烈诱导chb基因簇（22.7至74.0倍）和nagA、nagB基因（3.9至38.7倍）的表达，而GlcNAc的诱导作用较弱甚至不诱导nagA。chbR（位于chbC上游，编码GntR家族调控蛋白）突变后，在非诱导碳源（葡萄糖）下chb基因即呈现高表达，表明ChbR是chb基因的转录阻遏蛋白。EMSA实验证实ChbR直接结合chbR-chbB基因间区（推测含有chbBA和chbRCDE操纵子的启动子），但不结合chbC-chbR区间。有趣的是，ChbR也能微弱结合nagB启动子，且chbR突变体中nagB在GlcNAc下的诱导水平显著高于野生型，表明ChbR对nagB也有间接阻遏作用。

另一调控蛋白NagR（与nagA共转录，同属GntR家族）主要调控nag基因簇。nagR突变体中，nagA和nagB的表达在所有测试糖源下均显著升高，EMSA显示NagR直接结合nagA和nagB的启动子区域，但不结合chb基因的启动子。生物信息学分析发现ChbR和NagR的推定结合位点为部分回文的14 bp序列，与链霉菌DasR等已知调控因子的结合位点相似，并可能与启动子的-10区重叠，符合其阻遏功能。

推定chb操纵子在其它细菌中的遗传组织

对ChbD同源蛋白的基因组环境分析发现，类似的chb基因簇（包含PTS组件、chbD和chbE同源物）存在于其他乳酸菌属（如Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus）以及Caldifermentibacillus hisashii等菌株中，但其基因内容和排列顺序存在变异，部分菌株缺失完整的PTS组件或调控基因。

结论与意义

本研究首次在乳酸杆菌目细菌中完整阐明了ChbNAc的代谢途径：由特异的PTS^Chb转运并磷酸化，随后被GH170家族水解酶ChbE切割，最终代谢产物通过NagA和NagB进入中心碳代谢。该通路受到ChbR和NagR构成的双重转录阻遏系统精细调控，其中ChbNAc-P可能是ChbR的诱导物，而葡萄糖胺-6P（GlcN-6P）可能是NagR的诱导物。这种调控网络确保了菌株仅在存在相应底物时才启动耗能的代谢基因表达，同时协调了ChbNAc分解与GlcNAc回收（如细胞壁周转）之间的关系。

值得注意的是，L. paracasei的ChbNAc代谢途径与大肠杆菌（需要先脱乙酰再水解）或某些采用ABC转运体和胞内GH3水解酶的细菌（如链霉菌）存在明显差异，其特有的ChbD蛋白功能以及使用GH170家族水解酶代表了新的代谢策略。这些chb和nag基因簇很可能构成了一种进化适应，使L. paracasei能够利用宿主黏膜和饮食中丰富的N-糖链成分，从而增强其在胃肠道环境中的定植竞争力。这项工作不仅增进了对益生菌碳源利用机制的基础理解，也为开发针对特定糖类利用能力的优良益生菌株提供了理论依据。