噬菌体休克蛋白响应调控单核细胞增生李斯特菌对多肽细菌素garvicin KS的耐受性

《Applied Microbiology and Biotechnology》：The phage shock protein response of Listeria monocytogenes influences tolerance to the multipeptide bacteriocin garvicin KS

本研究针对高价值易腐食品（如冷熏三文鱼）中单核细胞增生李斯特菌污染导致的保质期短及食品安全问题，通过分析鱼类加工环境分离菌株对多肽细菌素garvicin KS（GarKS）的敏感性，结合RNA测序与耐药突变体筛选，发现GarKS可激活噬菌体休克蛋白（psp）响应通路，且耐药突变频率极低（10-9–10-11）。关键基因lmo2486（编码PspC结构域蛋白）的突变或过表达直接调控细菌对GarKS的耐受性，为开发新型生物防腐剂提供了重要靶点。

　　

在全球每年超过10亿吨食物被浪费的背景下，高价值易腐食品（如冷熏三文鱼）的保鲜尤为棘手。这类产品在开封后仅能保存数日，主要归因于单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的污染风险。该病原体不仅耐受低温、高盐环境，还能在食品加工设备表面形成生物膜，传统热杀菌技术又易破坏食品感官品质。因此，开发非热杀菌技术成为研究热点，其中细菌素（bacteriocin）与高压处理（HPP）联用的“栅栏技术”备受关注。然而，现有细菌素如尼生素（nisin）或片球菌素PA-1存在耐药性发展快、化学稳定性差等问题。本研究聚焦于一种新型多肽细菌素garvicin KS（GarKS），其由乳酸乳球菌（Lactococcus garvieae）产生，由三条肽链（GakABC）构成，对单核细胞增生李斯特菌表现出纳摩尔级抗菌活性，且可通过乳基培养基高效生产，具备产业化潜力。

为评估GarKS的应用前景，研究人员首先测定了13株来源于鱼类及其加工环境的单核细胞增生李斯特菌菌株对GarKS的敏感性，发现最小抑菌浓度（MIC₉₀）介于20–275 nM之间，显著优于尼生素（约2 μM）。进一步通过耐药突变频率实验，发现菌株RO15在GarKS压力下产生耐药性的频率极低（10^-9–10^-11），且耐药突变体的MIC₉₀仅提高至多8倍，表明GarKS不易诱导高水平耐药。

通过RNA测序分析，团队发现GarKS处理20分钟后，菌株RO15中22个基因表达上调，其中噬菌体休克蛋白（phage shock protein, psp）相关基因（lmo2484–lmo2487）显著激活。对耐药突变体的基因组测序显示，所有高耐受性突变均携带lmo2486基因的移码突变（c.12delA），导致PspC结构域蛋白功能丧失。功能验证实验中，回补完整lmo2486基因可使突变体恢复野生型敏感性，而过表达该基因则进一步增加野生菌对GarKS的敏感度，证实Lmo2486是调控GarKS耐受性的关键因子。

关键技术方法

研究采用微量稀释法测定GarKS对单核细胞增生李斯特菌的MIC₉₀；通过平板筛选法计算耐药突变频率；利用RNA测序（RNA-seq）分析GarKS胁迫下的转录组变化；通过PCR扩增与Sanger测序鉴定耐药突变位点；构建质粒pNZ-Ppsp实现psp基因的过表达与回补实验。

研究结果

1. 食源李斯特菌对GarKS高度敏感

13株菌的MIC₉₀值为20–275 nM，平均128 nM，表明GarKS对鱼类加工相关菌株具有广谱强效抑制作用。

2. GarKS耐药性发展罕见

耐药突变频率低于10^-9，且最高耐受浓度仅为8倍MIC₉₀（1000 nM），提示GarKS可能通过非蛋白靶点发挥作用。

3. GarKS激活噬菌体休克蛋白响应

转录组分析显示，lmo2486（PspC-toastrack融合蛋白）为最显著上调基因（log2FC=1.12），其所在操纵子（lmo2484–lmo2487）及其他膜应激相关基因（如ABC转运蛋白、阳离子外排系统）均被激活。

4. Lmo2486突变直接导致GarKS耐受

4株高耐受突变体均在lmo2486基因同一聚腺嘌呤序列（polyA）位点发生缺失突变，回补实验证实该蛋白功能缺失可降低GarKS敏感性3倍。

结论与意义

本研究首次揭示单核细胞增生李斯特菌对GarKS的耐受性受噬菌体休克蛋白通路调控，其中Lmo2486作为关键感应因子，其突变可通过影响细胞膜应激响应降低GarKS效力。与靶向Man-PTS（mannose phosphotransferase system）的细菌素（如片球菌素PA-1）相比，GarKS不易诱导耐药性，且与高压处理技术协同潜力大。该发现为优化GarKS在食品工业中的应用提供了理论依据，同时提示psp系统可作为新型抗菌靶点。论文发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》，为减少高价值水产品浪费、保障食品安全提供了创新解决方案。