《Applied Microbiology and Biotechnology》：Toward food-grade production of the Bacteroides helcogenes protein-glutamine glutaminase with an optimized Bacillus subtilis strain
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本文推荐：为解决植物蛋白功能特性改良用酶——蛋白-谷氨酰胺谷氨酰胺酶(PGB)的食品安全性生产难题，研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对未驯化枯草芽孢杆菌007进行多靶点基因组整合，成功构建无需抗生素标记的工程菌株。该研究通过sigF（孢子形成缺陷）、sfp（表面活性素合成缺陷）和amyE（α-淀粉酶基因座）三位点整合PGB表达盒，使酶活提升至9.5 μkat/L，同时消除发酵过程泡沫问题，为食品工业酶制剂生产提供了创新策略。
随着全球植物基食品需求的爆发式增长，如何改善植物蛋白的溶解性和功能特性成为食品工业的核心挑战。蛋白-谷氨酰胺谷氨酰胺酶(PG)能通过催化谷氨酰胺残基脱酰胺反应，在蛋白质分子中引入负电荷，显著提升其溶解性和乳化特性。其中源自Bacteroides helcogenes的新型PGB酶，因其卓越的热稳定性和抗氨产物抑制能力，被业界视为替代传统Chryseobacterium proteolyticum来源PGC的理想候选。然而，食品酶制剂的生产必须符合欧盟食品安全局(EFSA)的严格标准，要求生产菌株不具备抗生素抗性基因且无毒性代谢产物风险。
在这项发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》的研究中，Jana Senger团队以具有"安全推定资格"(QPS)的枯草芽孢杆菌为宿主，开创性地通过多靶点基因组整合策略，实现了PGB的食品级高效分泌生产。研究人员首先完成了未驯化菌株B. subtilis 007的基因组测序，在此基础上运用CRISPR/Cas9技术将PGB表达盒精准插入三个关键基因位点：孢子形成关键因子sigF（构建无孢子菌株）、非核糖体肽合成关键基因sfp（消除泡沫问题）以及经典整合位点amyE（增强表达稳定性）。通过分批发酵工艺优化，最终使胞外PGB酶活达到9.5 μkat/L的行业领先水平。
研究团队通过系列实验揭示了不同基因位点改造的协同效应：sigF位点整合不仅阻断孢子形成途径，还利用aprE启动子实现4.1 μkat/L的基础产量；sfp基因敲除使发酵泡沫减少80%的同时，意外发现通过调控Spo0A磷酸化级联反应改变了蛋白酶表达谱；而amyE位点的第三拷贝整合则利用染色体复制起点邻近效应，使最终产量提升至原始菌株的2.3倍。值得注意的是，与预期相反的是flgE（鞭毛钩蛋白基因）位点改造并未提升产量，研究人员推测这与野生型菌株中完整的swrA（运动性主调控因子）信号通路有关。
这项研究的突破性在于将菌株优化与酶生产过程完美结合：一方面通过多拷贝整合实现产量倍增，另一方面精准剔除工业发酵中的不利性状。所构建的B. subtilis FS4菌株不仅完全符合食品安全生产规范，其300倍于大肠杆菌表达系统的产量优势更为工业化应用奠定基础。该策略为其他食品酶制剂的生物制造提供了可复用的技术范式，特别是对需要复杂翻译后修饰的酶类生产具有重要参考价值。
主要技术方法
研究采用Illumina测序获得B. subtilis 007全基因组序列，通过CRISPR/Cas9系统进行多位点基因编辑，使用含sgRNA和同源重组模板的pJOE8999质粒体系。发酵实验采用1L生物反应器进行分批培养，酶活检测通过HPLC定量Z-Gln-Gly底物转化率，蛋白质分泌谱采用SDS-PAGE结合质谱验证。
基因组序列分析揭示菌株特性
通过全基因组测序发现B. subtilis 007与野生型菌株NRS6181具有99.99%序列同源性，其基因组携带完整的sfp（4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶）和swrA（运动性调控）基因，这解释了该菌株在蔗糖培养基中产生大量表面活性素导致的泡沫现象。比较基因组学分析为后续靶点选择提供了理论依据。
多位点整合优化生产性能
sigF位点整合成功获得不产孢子工程菌FS1，实现4.1 μkat/L初始产量；sfp位点改造工程菌FS2在消除泡沫同时将产量提升至5.4 μkat/L，并发现胞外蛋白酶活性降低5倍的现象；flgE位点整合菌FS3产量反而下降至2.5 μkat/L，表明鞭毛系统改造在野生型背景下的复杂性；最终amyE位点整合使三重拷贝菌FS4产量达到9.5 μkat/L，SDS-PAGE显示21 kDa成熟PGB成为主要分泌蛋白。
讨论与展望
本研究首次在未驯化枯草芽孢杆菌中实现CRISPR/Cas9介导的多位点PGB表达，其产量显著高于文献报道的PGC在B. subtilis 168中的表达水平（0.6 U/mL）。值得注意的是，野生型菌株的天然蛋白酶系统恰好完成PGB前肽的切割激活，避免了额外加工步骤。未来可通过DegU（双组分调控系统反应调节蛋白）等转录因子改造进一步优化表达均一性，或采用补料发酵工艺突破细胞密度限制。该平台技术的成功建立，为其他需要复杂分泌途径的食品酶制剂生产提供了全新解决方案。
