乳铁蛋白增强三种凯病毒疗效并限制肺上皮细胞炎症反应的研究

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Addition of lactoferrin increases efficacy of three Kayviruses and limits the inflammatory response in pulmonary epithelial cells

本研究针对MRSA所致医院获得性肺炎治疗难题，创新性地将三种凯病毒（vB_SauM-A/C/D）与乳铁蛋白联用。结果表明：该组合能显著降低细菌载量，保护A549细胞免受感染损伤，并有效抑制caspase-1介导的炎症反应。这种非抗生素疗法为耐药菌肺炎治疗提供了新策略。

　　

在微生物与人类健康的永恒博弈中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）无疑是当代医学最棘手的对手之一。这种超级细菌尤其擅长在医院环境中引发肺炎，占所有医院获得性肺炎（Hospital-Acquired Pneumonia, HAP）病例的20%至50%。更令人担忧的是，当流感或SARS-CoV-2等病毒先一步削弱人体防御后，MRSA便会趁虚而入，导致病情急转直下，死亡率显著攀升。全球范围内，MRSA的平均感染率约为14.69%，但在某些地区如美国和部分亚洲国家，这一数字可高达50%至75%，构成了严重的公共卫生威胁。

传统上，医生们依赖利奈唑胺（Linezolid）或万古霉素（Vancomycin）等抗生素来对抗MRSA。然而，这些药物并非完美无缺。高达30%的患者在使用利奈唑胺后会出现血小板减少症，其他副作用还包括视神经病变、周围神经病变，甚至乳酸酸中毒。更重要的是，抗生素的滥用加速了耐药菌的进化，使得我们的武器库日渐枯竭。正是在这样的背景下，科学家们将目光投向了另一种古老的微生物克星——噬菌体（Bacteriophage）。

噬菌体是专门感染并裂解细菌的病毒，其疗法拥有超过百年的历史，但在抗生素时代一度被忽视。如今，随着耐药菌危机加剧，噬菌体疗法重新焕发生机。不过，噬菌体也有其局限性：它们通常只针对特定菌种，细菌也会进化出抗噬菌体机制。为了突破这些限制，研究人员开始探索将噬菌体与其他抗菌剂联用的策略。其中，乳铁蛋白（Lactoferrin, Lf）作为一种天然免疫蛋白，展现出巨大的潜力。它不仅本身具有抗菌和抗生物膜（Anti-biofilm）活性，还能与噬菌体产生协同效应。此前的研究已发现，乳铁蛋白能增强某些噬菌体的效价（Plaque Forming Unit, PFU）和裂解量（Burst Size），但这种组合在模拟人体肺部感染环境中的效果如何，特别是对宿主细胞炎症反应的影响，尚不清楚。

为此，波兰格但斯克医科大学（Medical University of Gdańsk）的Katarzyna Kosznik-Kwa?nicka领衔的研究团队在《Applied Microbiology and Biotechnology》上发表了一项重要研究。他们系统评估了三种凯病毒（Kayviruses）——vB_SauM-A、vB_SauM-C和vB_SauM-D，分别单独或与乳铁蛋白联用，对MRSA感染的肺上皮细胞的影响。研究不仅关注抗菌效果，还深入探讨了这些治疗策略对宿主细胞存活、膜完整性以及炎症信号通路的影响，为开发更安全、更有效的抗MRSA疗法提供了新的见解。

为开展这项研究，作者运用了几个关键技术方法：利用人肺上皮细胞系A549建立MRSA感染模型，模拟肺部感染环境；通过菌落形成单位（Colony-Forming Unit, CFU）计数和噬菌斑形成单位（Plaque Forming Unit, PFU）计数精确量化细菌和噬菌体的浓度；采用中性红（Neutral Red）染色法评估细胞活性，乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）释放实验检测细胞膜完整性；使用Caspase-Glo? 1试剂盒测量caspase-1活性以评估炎症小体（Inflammasome）的激活水平；并设计了Transwell实验来研究噬菌体能否穿透细胞层（即噬菌体转胞吞作用，Phage Transcytosis）。研究所用的MRSA临床分离株来自格但斯克医科大学的菌种保藏中心。

研究结果

3.1. 噬菌体与乳铁蛋白对细胞安全性的影响

研究人员首先确认了治疗成分本身对未感染A549细胞的安全性。将细胞分别暴露于浓度为1×10⁹PFU/mL的三种噬菌体、1 mg/mL的乳铁蛋白、噬菌体与乳铁蛋白的混合物以及2 mg/mL的利奈唑胺中。通过中性红染色评估细胞活性，LDH释放实验评估细胞膜损伤，以及caspase-1活性检测炎症反应。结果显示，无论是单独的噬菌体、乳铁蛋白，还是它们的组合，均未对A549细胞的活性和膜完整性产生负面影响，也未引起炎症小体的异常激活。与之形成对比的是，抗生素利奈唑胺处理导致了约20%的细胞活性下降和caspase-1活性降低，这提示抗生素可能对宿主细胞有直接的毒性作用。

3.2. 感染模型中噬菌体与乳铁蛋白的抗菌效力

在A549细胞被MRSA感染后，研究人员评估了不同治疗方案的抗菌效果。感染两小时后加入治疗物质，并在3小时和6小时后检测培养基中的细菌载量（CFU/mL）。结果显示，在3小时时间点，大多数治疗组合（噬菌体单独、乳铁蛋白单独或联合）都显著降低了三种MRSA菌株（70号、110号、203号）的数量，其中噬菌体与乳铁蛋白联用通常比单独使用噬菌体效果更好。利奈唑胺在3小时时就将所有菌株的细菌量降至检测限以下，显示出最快的杀菌速度。到6小时时，联合治疗的优势更加明显。对于70号MRSA菌株，vB_SauM-A + Lf和vB_SauM-D + Lf处理使其CFU/mL降至检测限以下（约100 CFU/mL）。对于203号菌株，vB_SauM-A + Lf也达到了同样效果。对于110号MRSA菌株，虽然联合治疗未能将细菌完全清除，但将其数量降至约5×10⁴CFU/mL，显著优于单独噬菌体处理（约10⁶CFU/mL）。这表明乳铁蛋白确实能够增强特定噬菌体的抗菌活性，使其在较长时间内达到与抗生素媲美的效果。

3.3. 治疗对感染细胞存活的影响

MRSA感染会对宿主细胞造成严重损伤。本研究通过中性红染色和LDH释放实验，评估了治疗能否保护A549细胞免受这种损伤。在70号MRSA感染模型中，所有治疗在3小时内均能抑制细菌的毒性效应，维持细胞活性。到6小时，只有利奈唑胺、vB_SauM-A以及噬菌体+Lf组合仍能有效阻止细胞活性的进一步下降。LDH水平在各组间无显著差异。在110号MRSA感染模型中，除vB_SauM-C外，所有治疗在6小时后均显示出保护作用，但噬菌体+Lf组合的统计学显著性更高，且其LDH释放量也显著低于感染对照组。在203号MRSA感染模型中，所有治疗在6小时后均表现出显著的细胞保护作用，其中纯噬菌体和噬菌体+Lf处理的效果在统计学上优于利奈唑胺或乳铁蛋白单独使用。这些结果说明，噬菌体疗法，尤其是与乳铁蛋白联用时，不仅能杀死细菌，还能有效保护宿主细胞，减轻感染带来的直接损伤。

3.4. 治疗对炎症小体激活的抑制作用

过度的炎症反应是细菌性肺炎导致组织损伤的重要原因。研究人员检测了治疗6小时后A549细胞中caspase-1的活性，以此判断炎症小体的激活程度。结果显示，与未治疗的感染对照组相比，所有治疗方案（利奈唑胺、乳铁蛋白、单独噬菌体、噬菌体+Lf）均显著降低了caspase-1的活性。在70号MRSA感染中，利奈唑胺和噬菌体+Lf组合抑制炎症的效果最好。在110号和203号MRSA感染中，利奈唑胺以及某些噬菌体+Lf组合（如vB_SauM-C+Lf, vB_SauM-D+Lf）也表现出强大的抗炎效果。值得注意的是，单独噬菌体治疗也能将炎症水平降低至甚至低于未感染对照组的水平，表明这些凯病毒本身具有一定的抗炎特性。乳铁蛋白的加入虽然没有进一步大幅降低已经很低炎症水平，但也没有带来任何促进炎症的不良反应。

3.5. 噬菌体转胞吞作用评估

噬菌体疗法的一个安全顾虑是噬菌体可能穿透人体细胞屏障，扩散到全身。研究人员利用Transwell系统模拟肺上皮屏障，研究了三种噬菌体在有无乳铁蛋白存在下的穿透能力。预实验证实噬菌体可以穿透Matrigel?基质而不失活。正式实验中，将噬菌体加入上室，培养24小时后检测下室培养基和底部细胞中的噬菌体量。结果显示，vB_SauM-A和vB_SauM-D能够穿透A549细胞层，回收率约为初始剂量的0.015%。乳铁蛋白的添加对这两个噬菌体的穿透没有显著影响。vB_SauM-C能穿透Matrigel?，但在有细胞存在时无法被回收，表明它可能无法有效穿越细胞本身。最重要的是，在所有情况下，均未在底部的A549细胞中检测到噬菌体，说明其系统扩散能力非常有限。乳铁蛋白的添加还略微提高了噬菌体在细胞层上的存留率。这表明，在肺部局部应用噬菌体-乳铁蛋白组合，引发噬菌体全身性扩散的风险较低。

结论与展望

本研究深入探讨了三种凯病毒（vB_SauM-A, vB_SauM-C, vB_SauM-D）与乳铁蛋白联用，在MRSA感染的肺上皮细胞模型中的综合效果。结果表明，这种非抗生素组合拳展现出了令人鼓舞的应用前景：它不仅有效降低了耐药菌的负荷，其抗菌效力在联用乳铁蛋白后得到增强，甚至在某些情况下能达到与标准抗生素利奈唑胺相当的水平；更重要的是，它能显著减轻感染对宿主细胞的毒性损伤，并有效抑制由caspase-1介导的过度炎症反应。此外，研究还证实了治疗成分自身对细胞的安全性，并提示噬菌体在肺上皮屏障的穿透能力有限，降低了全身扩散的潜在风险。

这项研究的发现具有多重意义。首先，它为应对日益严峻的MRSA肺炎，尤其是继发于病毒感染的病例，提供了一种潜在的替代或辅助治疗策略，有助于减少对抗生素的依赖。其次，它揭示了噬菌体与天然免疫蛋白（乳铁蛋白）协同作用的潜力，为优化噬菌体疗法提供了新思路。最后，研究涵盖了抗菌效果、宿主细胞保护和免疫调节等多个维度，体现了从单纯“杀菌”到“菌-宿主”双重干预的先进治疗理念。

当然，这项研究仍处于体外实验阶段。作者也指出，未来需要扩大噬菌体和宿主细胞的类型进行验证，并进一步在动物模型上评估这种组合对整体免疫反应的影响，以期最终为临床转化奠定坚实的基础。尽管如此，这项成果无疑为我们在对抗超级细菌的征途中，点亮了一盏新的指路明灯。