《Journal of Biological Chemistry》：Transient Receptor Potential Vanilloid 4 in Macrophages Mediates TGF-β Activation to Drive Myofibroblast Differentiation and Pulmonary Fibrosis
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本研究聚焦于肺纤维化进程中巨噬细胞-成纤维细胞相互作用的关键机制。研究人员发现，巨噬细胞机械敏感离子通道TRPV4能够响应病理范围基质刚度，通过其C端胞内尾区与肌动球蛋白细胞骨架结合产生机械力，从而优化转化生长因子-β（TGF-β）的活化。该TRPV4-TGF-β轴驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，特异性敲除髓系细胞TRPV4可显著减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，为靶向局部TGF-β激活治疗纤维化疾病提供了新策略。
在肺部，当组织受到损伤时，通常会启动修复过程。然而，在某些情况下，这种修复反应会失控，导致细胞外基质过度沉积和组织瘢痕形成，即肺纤维化。纤维化性间质性肺病（fILDs）是一类进行性、高死亡率的疾病，目前缺乏有效的治愈手段。其病理标志是肌成纤维细胞的积累，这些细胞具有分泌大量细胞外基质蛋白（如胶原蛋白）和促纤维化细胞因子（如转化生长因子-β, TGF-β）的特性。肌成纤维细胞的发育、促纤维化作用及其清除若在时空上调控失常，便会导致进行性纤维化。因此，阐明介导肌成纤维细胞分化的关键信号对于改善多种器官的纤维化至关重要。
传统上，成纤维细胞被认为是纤维化的关键效应细胞，而免疫细胞（如巨噬细胞）的作用则存在争议。但越来越多的证据表明，巨噬细胞-成纤维细胞相互作用可以驱动器官纤维化。特别是，肺泡巨噬细胞持续存在于纤维化的前沿——成纤维细胞灶，支持其在纤维生成中的重要作用，但其具体机制尚不明确。肌成纤维细胞分化是对细胞外基质机械力的反应，是纤维化发展中的重要环节。新兴证据表明，机械敏感阳离子通道，如Piezo 1、Piezo 2和瞬时受体电位香草素成员4（Transient Receptor Potential Vanilloid 4, TRPV4），在肺纤维化的发病机制中扮演重要角色。先前的研究已证实成纤维细胞中的TRPV4在TGF-β诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化以及实验性肺纤维化中起作用。此外，巨噬细胞的活化也依赖于基质刚度，这是一个先前未被充分认识的效应，因为传统的体外实验通常在硬度远超肺组织的组织培养塑料或玻璃上进行。
TRPV4是一种广泛表达的机械敏感阳离子通道，但其作用具有细胞类型和背景特异性，这可能源于TRPV4与其他信号通路的交叉对话。这种交叉对话可能通过TRPV4的胞内氨基和羧基末端尾或其阳离子通道功能介导。基于此，本研究旨在揭示巨噬细胞TRPV4依赖的、此前未知的促纤维化作用。发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究，阐明了巨噬细胞中的TRPV4是驱动TGF-β活化、诱导肌成纤维细胞分化并介导实验性肺纤维化的关键因子。
为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术方法。在体内层面，使用了髓系细胞特异性Trpv4基因敲除（Trpv4LysMCre）小鼠模型，通过气管内滴注博来霉素诱导肺纤维化，并利用羟脯氨酸含量测定、免疫印迹检测胶原-1、肺功能（顺应性）测量以及组织病理学（H&E和天狼星红染色）分析纤维化程度。在体外层面，从野生型（WT）和Trpv4基因敲除（KO）小鼠获取骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），将其培养在模拟正常肺（1 kPa）和纤维化肺（8, 25 kPa）硬度的聚丙烯酰胺凝胶上，收集条件培养基（CM）并将其转移至野生型小鼠肺成纤维细胞（MLFs）或与之间接共培养，以评估其对肌成纤维细胞分化的影响。技术手段包括免疫荧光染色检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）应力纤维形成、免疫印迹分析胶原-1表达、小干扰RNA（siRNA）敲低SMAD蛋白、TGF-β受体激酶抑制剂（SD208）处理、TGF-β中和抗体或免疫沉淀去除TGF-β活性，以及利用貂肺上皮细胞（MLEC）报告系统检测TGF-β活化水平。此外，还使用了细胞骨架功能抑制剂（如细胞松弛素D、jaksplakinolide、blebbistatin）和慢病毒载体介导的TRPV4突变体（全长、C末端缺失、肌动球蛋白结合位点突变）在Trpv4KO BMDMs中的表达，以探究TRPV4功能结构域的作用。
TRPV4缺失在髓系细胞中保护肺部免受博来霉素诱导的肺纤维化
为了研究髓系细胞中TRPV4在体内肺纤维生成中的作用，研究人员比较了髓系特异性Trpv4KO小鼠（Trpv4LysMCre）与其亲本对照（Trpv4fl/fl）在气管内滴注博来霉素后的反应。髓系特异性Trpv4KO小鼠对博来霉素诱导的纤维化具有显著保护作用，表现为肺羟脯氨酸含量降低超过50%，肺组织胶原-1水平下降，肺顺应性改善，组织学染色（H&E和天狼星红）显示纤维化减轻。支气管肺泡灌洗液（BALF）分析显示淋巴细胞浸润减少25%，总蛋白降低50%。这些数据共同支持髓系细胞中的TRPV4介导了体内对博来霉素的纤维化反应。
巨噬细胞产生一种TRPV4和基质刚度依赖性因子诱导肌成纤维细胞分化
研究人员假设TRPV4可能在巨噬细胞的促纤维化作用中扮演角色。他们将WT和Trpv4KO BMDMs培养在不同硬度的基质上，收集条件培养基并转移至WT小鼠肺成纤维细胞。结果显示，来自培养在25 kPa硬度和组织培养塑料上的WT BMDMs的条件培养基能诱导肌成纤维细胞分化（表现为α-SMA应力纤维形成和胶原-1表达增加），而来自Trpv4KO BMDMs的条件培养基则无此效应，即使在高硬度基质上也是如此。这表明巨噬细胞产生了一种TRPV4和基质刚度依赖性的可溶性因子，能够驱动肌成纤维细胞分化。
TGF-β是条件培养基中诱导肌成纤维细胞分化的促纤维化因子
鉴于巨噬细胞能产生TGF-β，研究人员验证了TGF-β是否为关键因子。使用TGF-β受体激酶抑制剂SD208处理成纤维细胞，或通过siRNA敲低成纤维细胞中的SMAD3蛋白，均能阻断WT BMDMs条件培养基诱导肌成纤维细胞分化的能力。更重要的是，使用中和抗体或免疫沉淀法去除WT BMDMs条件培养基中的TGF-β，可显著降低其促肌成纤维细胞分化作用。这些数据强有力地表明，巨噬细胞来源的TGF-β以TRPV4和基质刚度依赖的方式启动经典的TGF-β信号通路，驱动成纤维细胞的肌成纤维细胞分化。
Trpv4 KO巨噬细胞的TGF-β活化受损
令人意外的是，WT和Trpv4KO BMDMs条件培养基中的总TGF-β抗原水平相似且不依赖于基质刚度。为了解释这一矛盾，研究人员检测了TGF-β的活化水平。发现WT BMDMs条件培养基中含有更多的活性TGF-β，其活性/总TGF-β比值显著高于Trpv4KO BMDMs的条件培养基。在巨噬细胞-成纤维细胞共培养体系中，与Trpv4KO BMDMs共培养可减少约42%的肌成纤维细胞数量，并且共培养体系中的TRPV4依赖性TGF-β活化能力差异比单独巨噬细胞条件培养基转移实验更为显著，这支持了细胞间接触对TGF-β活化的重要性。
TGF-β的活化依赖于TRPV4上的肌动球蛋白细胞骨架功能
研究人员进一步探讨了细胞骨架在TRPV4介导的TGF-β活化中的作用。使用破坏肌动蛋白稳定性或功能的抑制剂（细胞松弛素D、jaksplakinolide）或肌球蛋白II ATP酶抑制剂（blebbistatin）处理WT BMDMs，可降低其TGF-β活化能力，但不影响总TGF-β的分泌。重要的是，blebbistatin处理将WT BMDMs诱导肌成纤维细胞分化的能力降至Trpv4KO BMDMs的水平，而对Trpv4KO BMDMs无额外影响。这表明TRPV4的效应完全依赖于其调控细胞骨架稳定性的能力。
TGF-β的活化依赖于TRPV4上C端结构域的肌动球蛋白结合区
鉴于肌动球蛋白细胞骨架功能的重要性以及已知TRPV4的C端胞内尾可与肌动球蛋白结合，研究人员构建了缺失C端结构域（氨基酸723-871）的TRPV4突变体。在Trpv4KO BMDMs中表达此突变体，其恢复TGF-β活化和诱导肌成纤维细胞分化的能力显著低于表达全长TRPV4的细胞，与未转导或空载体转导的KO细胞水平相当。为进一步证实，研究人员表达了TRPV4肌动球蛋白结合位点特异性突变体，发现其激活TGF-β的能力也较全长TRPV4受损约30%。这些数据为TRPV4-肌动球蛋白结合位点在介导TGF-β活化和肌成纤维细胞分化中的重要性提供了进一步证据。
本研究结论表明，巨噬细胞中的机械敏感离子通道TRPV4通过其C端肌动球蛋白结合域与细胞骨架相互作用，产生机械力，从而优化TGF-β的活化。这一新发现的巨噬细胞TRPV4-TGF-β轴是驱动成纤维细胞向肌成纤维细胞分化及实验性肺纤维化的关键机制。值得注意的是，TRPV4并不影响TGF-β的分泌总量，而是调控其从潜伏状态向活化状态的转化。
讨论部分强调，这项研究深化了对巨噬细胞如何通过机械感应机制促进纤维化的理解。肺纤维化（如特发性肺纤维化IPF）的发生发展与组织微环境硬化密切相关，衰老等因素也会改变基质的生物物理特性。巨噬细胞，特别是单核来源的巨噬细胞，在纤维化病灶中富集，并且scRNA-seq数据表明IPF患者巨噬细胞中TRPV4表达上调。本研究揭示了巨噬细胞能感知病理范围内的基质刚度，并通过TRPV4依赖的机制活化TGF-β，从而打破纤维化进程中的自我延续循环。
研究的意义在于为治疗纤维化疾病提供了新的潜在靶点。直接靶向TGF-β因其多效性而面临挑战。而针对巨噬细胞中TRPV4依赖的、局部化的TGF-β活化过程，可能提供一种更具特异性、副作用更小的治疗策略。通过干预TRPV4的特定功能域（如C端肌动球蛋白结合位点）或其介导的机械力传导过程，有望特异性阻断纤维化进程中的关键环节，为开发抗纤维化新药开辟了方向。总之，这项工作不仅揭示了巨噬细胞在纤维化中的新颖机制，也凸显了靶向机械生物学通路在治疗慢性纤维化疾病中的广阔前景。
