《LWT》：Multi-omics joint analysis of biofilm formation in kefir-derived mixed strains
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本研究针对开菲尔粒胞外基质形成机制不清的问题，通过代谢组学与宏转录组学联合分析，系统解析了乳酸菌-酵母-醋酸菌混合体系生物膜形成的动态调控网络。研究发现4 h为微生物黏附期（AI-2信号峰值），8 h为生物膜成熟期（TCA循环下调），12 h进入稳态维持期（肽聚糖合成抑制），揭示了LuxS/AI-2群体感应系统通过调控鸟氨酸代谢、PTS系统等通路影响生物膜形成，为人工合成开菲尔粒提供了理论依据。
在微生物的世界里，生物膜如同一个精密的“微型城市”，微生物细胞被自身分泌的胞外聚合物包裹，形成具有复杂结构的群落。开菲尔粒作为一种天然混合微生物体系（包含乳酸菌、酵母和醋酸菌），其胞外基质的形成机制一直是学界未解的难题。由于传统开菲尔粒增殖缓慢且依赖现有颗粒传代，制约了工业化生产，解析其形成机制对实现发酵过程优化至关重要。
发表于《LWT》的最新研究通过多组学联合分析，首次系统揭示了开菲尔源混合菌株生物膜形成的分子调控网络。研究团队选取从开菲尔粒中分离的强生物膜形成能力菌株——开菲尔乳杆菌（Lentilactobacillus kefiri KL43）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus KY7）和法巴醋杆菌（Acetobacter fabarum KA26），构建三元共培养体系，在4小时、8小时和12小时三个关键时间点进行代谢组学与宏转录组学分析。
关键技术方法包括：利用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学检测，通过Compound Discoverer 3.1进行峰识别和代谢物鉴定；采用MGI-T7平台进行宏转录组测序，使用Trimmomatic进行数据质控，MEGAHIT进行序列组装，并通过KEGG数据库进行功能注释；运用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等统计方法解析组间差异。
3.1. 代谢组学分析
3.1.1. 整体代谢物组成
检测到10类代谢物，有机酸（30.20%）和脂质（26.05%）占比最高。KEGG注释显示代谢通路高度活跃，涉及氨基酸代谢、脂代谢等，环境信息处理模块中膜转运和信号转导通路富集，提示群体感应（QS）分子可能参与调控。
3.1.3. 差异代谢物分析
4 h vs 8 h比较组发现217个差异代谢物（88上调/129下调），8 h vs 12 h组200个（106上调/94下调）。脂质相关物质在上调代谢物中占比最高（如8 h vs 12 h组达31.13%），而有机酸在下调代谢物中主导（4 h vs 8 h组达58.91%）。
3.1.4. 差异代谢物KEGG富集分析
4 h vs 8 h组差异代谢物富集于mTOR信号通路、TCA循环（柠檬酸下调）和群体感应等通路。L-精氨酸和柠檬酸在8 h显著下调，而L-鸟氨酸上调，符合生物膜成熟期代谢活性降低的特征。8 h vs 12 h组中，肽聚糖前体N-乙酰胞壁酸下调，酚类物质对香豆酸（pCA）上调，后者可通过破坏群体感应信号抑制生物膜。12 h时花生四烯酸和环磷酸腺苷（cAMP）下调，反映微生物活性下降及第二信使通路抑制。
3.2. 宏转录组学分析
3.2.2. 样本间基因表达整体差异
4 h、8 h和12 h时间点基因表达谱显著分离，4 h特有基因数最多（139个），三时间点共有基因6704个。
3.2.3. 差异表达基因及功能富集
4 h vs 8 h组发现2714个差异基因（120上调/2594下调），其中90%以上代谢相关基因下调，包括TCA循环关键酶基因（gltA、IDH3等）。8 h vs 12 h组824个差异基因（234上调/590下调），富集通路转向细胞过程与遗传信息处理。12 h时群体感应相关基因（17个）全部下调，肽聚糖合成基因（如mraY、murD）抑制，与生物膜解体现象一致。
3.2.4. 多组学联合分析
相关性网络显示1595个代谢物与5648个基因关联（607,583对）。TCA循环中柠檬酸下调与gltA等基因抑制吻合；鸟氨酸代谢中rocD下调而argH/argG上调，驱动精氨酸向鸟氨酸转化；glmS基因表达与N-乙酰胞壁酸水平同步变化，证实转录-代谢协同调控。
3.2.5. 开菲尔粒胞外基质形成机制
研究构建了LuxS/AI-2群体感应系统介导的三阶段调控模型：4 h为AI-2信号峰值期，微生物通过焦点黏附通路初始定植；8 h AI-2活性骤降，能量重分配至胞外聚合物合成，生物膜成熟；12 h AI-2持续低水平，肽聚糖合成抑制引发结构解体。该模型将混合菌生物膜形成与开菲尔粒胞外基质发育直接关联。
4. 结论
研究通过双组学整合分析，阐明开菲尔源混合菌生物膜形成存在三阶段动态调控：4 h为微生物增殖期，8 h为基质合成期，12 h进入稳态维持期。LuxS/AI-2系统通过调控TCA循环、鸟氨酸代谢等通路影响代谢物积累，最终决定生物膜命运。该研究不仅验证了开菲尔粒形成的“生物膜假说”，更为人工设计开菲尔发酵剂提供了靶点依据。
