《New Biotechnology》：Utilization and valorization of lignin and lignin-derived compounds by
Pseudomonas putida KT2440: a new role for glutathione peroxidase
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本研究针对木质素高效降解与增值化的瓶颈问题，探讨了恶臭假单胞菌KT2440分泌型氧化酶的功能。研究人员通过CRISPR-Cas9/3系统敲除谷胱甘肽过氧化物酶基因（PP_1686，原注释为多功能过氧化物酶VP）和染料脱色过氧化物酶基因（PP_3248），发现ΔPP_1686突变体在木质素衍生化合物利用中生长受损，且pobA（对羟基苯甲酸羟化酶）表达下降、DNA修复模块下调，同时能量和氧化还原供应通路上调。该工作揭示了细菌GPx除清除ROS外，在维持木质素代谢氧化还原平衡中的新角色，为木质素增值化策略提供了新靶点。
木质素作为植物细胞壁中含量最丰富的芳香族聚合物，其复杂的结构和多样的连接方式使其成为自然界中最难降解的物质之一。目前，木质素的利用主要局限于燃烧产热或用于生产低附加值产品，如胶粘剂和树脂。化学降解方法往往产生复杂且难以定义的混合物，不适合高价值应用。因此，开发高效、可控的生物降解策略，特别是利用微生物将木质素转化为有价值的化学品，已成为当前研究的焦点。在这种背景下，恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440因其卓越的代谢多样性和对芳香化合物的降解能力，被视为一种极具潜力的微生物底盘细胞。然而，对于该菌株中负责降解复杂木质素并将其转化为明确小分子化合物的具体酶系统，人们仍知之甚少。
以往的研究大多集中在真菌来源的木质素降解酶，如漆酶（Lac）、木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）等。相比之下，细菌中的相关酶研究较少，但它们可能提供更特异、更可控的转化路径。近期研究表明，恶臭假单胞菌NX-1菌株能够以克拉夫特木质素作为唯一碳源生长，其基因组中预测存在多种可能与木质素分解相关的酶，包括Dyp型过氧化物酶、多功能过氧化物酶（VP）等。然而，这些酶在木质素降解中的具体功能尚未得到实验证实。特别引人注目的是，一个原本在KT2440中被注释为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的基因（PP_1686），在NX-1菌株中却被注释为多功能过氧化物酶（VP）。GPx通常被认为是细胞内重要的抗氧化酶，负责清除过氧化氢（H2O2）和有机过氧化物，以维持细胞的氧化还原稳态。一个看似负责抗氧化防御的酶，是否真的在细胞外木质素大分子的初始降解中扮演角色？这成为了一个亟待解答的科学问题。
为了解决这一问题，来自莱顿大学的研究团队在《New Biotechnology》上发表了一项研究，旨在鉴定恶臭假单胞菌KT2440中特异性参与木质素降解的酶，并深入探究一个特殊的GPx同源物——PP_1686的功能。研究人员推测，木质素的胞外氧化降解会产生活性氧（ROS），而细菌需要有效的机制来应对由此产生的氧化应激。PP_1686作为一个预测具有分泌信号的GPx，可能在这种应激响应和木质素代谢的交叉网络中起到关键作用。
为开展本研究，研究人员运用了几项关键的技术方法。首先，通过生物信息学分析（BLAST比对和SignalP信号肽预测）从恶臭假单胞菌KT2440基因组中筛选出可能与木质素降解相关的候选分泌酶。其次，利用CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas3基因组编辑技术，分别构建了PP_1686（ΔVP）和PP_3248（ΔDypB）基因敲除突变体。第三，通过微生物生长曲线测定、高效液相色谱（HPLC）分析以及木质素模型染料亚甲基蓝（MB）脱色实验，在体外评估了野生株和突变体对木质素衍生芳香化合物（如对香豆酸CA、阿魏酸FA、芥子酸SA）的利用能力。最后，对在混合芳香化合物培养基中生长的野生株和ΔVP突变体进行了RNA测序（RNA-seq）转录组学分析，以揭示基因敲除所引起的全局性转录响应。所有实验均设置了生物学重复以确保结果的可靠性。
3.1. 酶学BLAST比对与分析
研究人员通过比较基因组学分析，将恶臭假单胞菌NX-1中已报道的木质素降解酶同源物在KT2440基因组中进行定位。结果显示，KT2440中存在多个同源酶，包括Dyp型过氧化物酶（PP_3248）、漆酶/多铜氧化酶以及一个令人惊讶的靶点——与NX-1中VP高度同源的基因，该基因在KT2440中的对应基因为PP_1686，其原始注释为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。序列比对显示，PP_1686与NX-1的VP同源物具有高度相似性，并且预测含有Sec分泌系统信号肽，提示它可能是一个分泌蛋白。基于此分析，研究选择PP_1686（命名为VP/GPx）和PP_3248（DypB）作为后续功能表征的重点。
3.2. 在木质素衍生化合物上的生长
为了评估PP_1686和PP_3248在木质素代谢中的功能，研究人员比较了野生株（WT）、ΔVP和ΔDypB突变体在以对香豆酸（CA）、阿魏酸（FA）、芥子酸（SA）或其混合物作为唯一碳源的基本培养基中的生长情况。结果表明，ΔVP突变体在CA和混合底物上的生长显著受损，而在FA上的生长受影响较小。ΔDypB突变体在所有测试条件下均未表现出明显的生长缺陷。所有菌株均不能利用SA生长。这一结果初步表明PP_1686，而非PP_3248，在KT2440利用H型和G型木质素衍生单元中发挥着重要作用。
3.3. 亚甲基蓝的降解
为了进一步验证酶的木质素降解活性，研究使用了亚甲基蓝（MB）脱色实验作为替代测定方法。与野生株相比，ΔVP突变体对MB的脱色能力显著降低（ΔVP约39% vs WT约57%），而ΔDypB突变体与野生株无显著差异。该实验间接支持了PP_1686可能参与类木质素结构的氧化分解过程。
3.4. PP_1686在木质素衍生化合物利用中的作用
通过HPLC定量分析CA和FA的消耗动力学，研究进一步证实了生长表型。在CA培养基中，ΔVP突变体消耗CA的速度慢于野生株，并且中间产物4-羟基苯甲酸（4-HBA）的积累模式也不同，提示其通过β-酮己二酸途径的代谢通量降低。在FA培养基中，ΔVP的底物消耗速率也略慢于野生株。在混合底物条件下，ΔVP对CA和FA的利用效率均低于野生株。这些数据表明，PP_1686的缺失影响了菌株对芳香化合物的代谢效率。
3.5. 转录组分析证实pobA在生长于木质素衍生化合物中的作用
为了深入理解PP_1686缺失导致表型的分子机制，研究人员对在混合底物中培养的WT和ΔVP菌株进行了转录组测序分析。结果揭示，ΔVP突变体中编码对羟基苯甲酸羟化酶的pobA基因表达显著下调。该酶是CA代谢途径中的关键酶，负责将4-HBA转化为原儿茶酸（PCA）。pobA的下调直接解释了ΔVP突变体在CA代谢上的缺陷。此外，ΔVP突变体还表现出DNA修复（如recA， recN）和核糖体蛋白编码基因的下调，同时三羧酸（TCA）循环、氧化磷酸化（如nuoC， atpD）和磷酸戊糖途径（如zwf）等相关基因表达上调。这种转录重编程现象表明，PP_1686的缺失导致细胞面临氧化应激，进而通过下调耗能过程（如翻译和DNA修复）并上调能量和还原力（NADPH）的产生来进行补偿，以维持氧化还原平衡。
本研究通过综合运用基因敲除、表型分析、代谢物检测和转录组学技术，揭示了恶臭假单胞菌KT2440中一个原本注释为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的基因PP_1686，在木质素衍生芳香化合物代谢中扮演着超越传统抗氧化功能的新角色。该酶不仅影响了对香豆酸和阿魏酸等底物的降解效率，还通过调控pobA等关键代谢基因的表达，以及引发全局性的转录重编程，将氧化应激响应与中心碳代谢和芳香化合物分解代谢紧密地耦合在一起。
这项研究的结论具有多重重要意义。首先，它拓展了我们对细菌GPx家族酶功能的认识，表明其功能不限于细胞内ROS清除，还可能参与胞外木质素降解相关的氧化还原调节。其次，研究鉴定出的PP_1686是连接氧化应激防御和木质素代谢网络的一个关键节点，这为理性改造恶臭假单胞菌，构建更高效、更鲁棒的木质素增值化细胞工厂提供了新的靶点和思路。例如，通过调控PP_1686的表达或活性，可能优化菌株在降解木质素过程中的氧化还原平衡，从而提高目标产品的产量。最后，转录组数据所揭示的应激与代谢的耦合机制，为理解微生物在面对复杂底物时的适应性策略提供了新的见解。未来的研究可以聚焦于阐明PP_1686酶活性的具体调控机制，以及其与其他抗氧化系统（如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶）之间的协同作用，从而更完整地描绘出恶臭假单胞菌应对木质素降解挑战的分子网络。
