《Plant Gene》：Resolving species delimitation in
Terminalia L. (Combretaceae) using a multilocus DNA barcoding approach
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Terminalia属拉贾斯坦五种物种通过四个分子标记（ITS、matK、rbcL、psbA-trnH）的多态系条形码分析，揭示matK具有最高物种区分度（ bootstrap>85%支持率），psbA-trnH和rbcL提供补充信息，ITS变异度低。该研究证实多标记框架在解决该属形态趋同和分类混乱问题中的有效性，推荐matK为核心条形码，结合其他标记用于植物分类和生物多样性保护。
Pramod Kumar | Vinod Kataria
生物技术单元，植物学系，Jai Narain Vyas 大学，Jodhpur，Rajasthan，印度
摘要
Terminalia 属（Combretaceae 科）包括形态相似、生态意义重要且具有药理价值的树种，分布于热带和亚热带地区。由于表型可塑性、形态趋同以及近缘类群之间的同物异名现象，Terminalia 属内的分类学研究仍然具有挑战性。本研究采用了多位点 DNA 条形码技术来阐明五个类群（T. pendula、T. pendula var. pendula、T. anogeissiana、T. coronata、T. coronata var. parvifolia）之间的物种关系和系统发育差异。这些样本均采集自印度拉贾斯坦邦。研究了四个分子位点：核基因组的 ITS 位点和质体基因组的 matK、rbcL 以及 psbA-trnH 位点，并进行了扩增和测序。使用 MEGA v.12.0 软件和 Kimura 2-Parameter 模型以及 1000 次自助法（bootstrap replicates）进行了序列比对和系统发育分析。质体区域表现出富 AT 的序列特征，而核基因组的 ITS 位点则具有较高的 GC 含量，反映了不同的进化约束。matK 位点包含了最多的简约信息位点，从而提供了更精确的物种水平分辨率。多位点联合系统发育树（自助法支持度 >85%）一致地将 T. anogeissiana 与其他类群区分开来，而其他位点则将 T. pendula、T. pendula var. pendula、T. coronata 和 T. coronata var. parvifolia 分组为密切相关的类群。这一分子框架为分类学澄清、生物多样性保护以及药用植物鉴定提供了基础，支持将 matK 作为核心条形码标记，并建议在未来的 Terminalia 系统学和分子生态学研究中结合使用 rbcL 和多位点方法。在四个位点中，matK 显示出最高的核苷酸多样性和简约信息位点数量，而 ITS 在该数据集中的变异较低。
引言
Terminalia 属（Combretaceae 科）包含超过 100 种物种，原产于热带和亚热带地区，其中一些具有生态、药用和经济价值（Mabberley, 2008; Das et al., 2020）。Terminalia 物种在传统阿育吠陀医学和优纳尼医学中因其心脏保护、肝脏保护、抗菌和抗氧化特性而受到重视。其中 T. arjuna、T. chebula 和 T. bellirica 是众所周知的物种，而 T. pendula 和 T. anogeissiana 也具有生态和药理意义（Chitra et al., 2024; Singh and Gupta, 2024; Verma and Meena, 2023; Chhavi and Sharma, 2020; Cock, 2015; Sharma and Bhandari, 2011）。Terminalia 物种不仅在药理学上重要，而且在木材生产、单宁提取以及干旱和半干旱地区的生态系统中也具有应用价值（Kumar & Rathore, 2025）。然而，由于形态趋同、表型可塑性以及与 Anogeissus、Pteleopsis 和 Buchenavia 等相关属的历史同物异名现象，Terminalia 物种的鉴定颇具难度。这种分类学复杂性阻碍了野外鉴定和保护工作（Maurin et al., 2017）。DNA 条形码技术通过使用短而统一的遗传信息序列有效解决了分类学上的模糊性，从而能够鉴定物种并推断系统发育关系（Letsiou et al., 2024; Yong et al., 2024）。CBOL 植物工作组推荐使用 matK + rbcL 作为核心植物 DNA 条形码，其中 rbcL 通常更适合属级鉴定（CBOL 植物工作组, 2009; Hollingsworth et al., 2009）。在本拉贾斯坦邦的 Terminalia 数据集中（n = 5 个类群），rbcL 显示出较高的平均成对距离和变异位点数量，这可能是由于采样有限、区域特有性或 GenBank 数据库采样不足所致。补充位点（ITS、psbA-trnH）提高了物种分辨率，证实了多位点条形码技术在解决分类学问题上的有效性。CBOL 植物工作组建议采用多位点方法，因为不同位点的进化速率不同：rbcL 支持更高层次的（属/科）系统发育定位，matK 提供物种级别的区分能力，ITS 可以区分密切相关的类群，而 psbA-trnH 可以提供多态性信息（CBOL 植物工作组, 2009; Hollingsworth et al., 2009）。在复杂属中，综合多位点框架比单一标记方法具有更高的分辨率（Kress et al., 2015; Mishra et al., 2017b）。基于 ITS、matK、psbA-trnH 和 rbcL 位点的综合多位点 DNA 条形码系统尚未在印度 Terminalia 物种中得到系统应用。Terminalia 与 Anogeissus 在系统发育上属于同一单系群（Maurin et al., 2017; Ribeiro et al., 2022）。尽管像 T. pendula 这样的物种在印度干旱地区广泛分布且具有重要的文化和药用价值，但来自该地区的研究较少。此外，Chen et al. (Chen et al., 2023a) 和 Zhu et al. (Zhu et al., 2022) 总结了草药 DNA 条形码的最新进展，强调了多位点框架在监管和质量控制应用中的必要性。本研究对来自印度拉贾斯坦邦的五个 Terminalia 类群进行了四个 DNA 条形码位点（ITS、matK、rbcL、psbA-trnH）的测序。研究目的包括：评估四个 DNA 条形码位点在 Terminalia 物种中的相对信息量，重建这五个类群之间的系统发育关系，并评估这些标记作为 Terminalia 分类学参考标准的潜力。
植物材料采集
植物材料采集
从印度拉贾斯坦邦的多个地点采集了所有五个 Terminalia 类群的幼叶（图 1）。其中 T. pendula var. pendula 和 T. coronata var. parvifolia （C.B.Clarke）Chakrab. & Anand Kumar 采自 Mount Abu, Sirohi；T. pendula （Edgew.）Gere & Boatwr. 采自 Jodhpur 的 Kaylana Lake；T. anogeissiana Gere & Boatwr. 采自 Pali 的 Sadri；T. coronata （Stapf）Gere & Boatwr. 采自 Jodhpur 的 Jai Narain Vyas 大学新校区。样本采集后立即进行了处理。
DNA 扩增和测序
从五个类群中成功提取了基因组 DNA，获得了四个位点的 19 个序列（psbA-trnH 位点因一次扩增失败仅有 4 个序列），这些序列具有较高的分子量和均匀的浓度。DNA 条形码的有效性很大程度上取决于 PCR 扩增的精确度和所用引物的可靠性。在本研究中，所有四个遗传标记（matK、rbcL、psbA-trnH 和 ITS）的扩增成功率均为 100%。预期的片段大小约为 700 bp。
讨论
本研究利用核基因组的 ITS 位点和质体基因组的 matK、rbcL、psbA-trnH 位点进行了多位点 DNA 条形码分析，以解决拉贾斯坦邦 Terminalia 的分类学问题，因为该地区的形态可塑性阻碍了物种鉴定（Kress et al., 2015; Maurin et al., 2017）。核苷酸分析显示质体位点（psbA-trnH、matK）富含 AT 序列，而核基因组的 ITS 位点富含 GC 序列，反映了基因组特异性的进化约束（Kress et al., 2017; Mishra et al., 2017b）。matK 位点在物种区分方面具有最高的简约信息量。
结论
这项多位点条形码研究展示了整合核基因组的 ITS 位点和质体基因组的 matK、rbcL、psbA-trnH 位点在研究五个 Terminalia 类群系统发育关系中的实用性。在这些标记中，matK 显示出最高的系统发育信息量，而 psbA-trnH 提供了额外的支持。本数据集中 ITS 位点的变异较低，表明应将其纳入多位点框架中，而不是单独使用。
CRediT 作者贡献声明
Pramod Kumar：撰写初稿、方法学设计、数据管理、概念构建。Vinod Kataria：撰写、审稿和编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢新德里的 University Grants Commission（UGC）提供的初级研究奖学金资助。同时，也感谢 Jodhpur 的 Jai Narain Vyas 大学（342001）植物学系提供的实验室基础设施，这对研究的顺利完成至关重要。
