《Nature Communications》：Single-cell multiplex approaches deeply map ON-target CRISPR-genotoxicity and reveal its mitigation by palbociclib and long-term engraftment
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本研究针对CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑中存在的靶向基因毒性风险，开发了结合单细胞SNP-DNA测序（scSNP-DNAseq）、微核检测及LOH流式报告系统的多重单细胞分析策略。研究团队在人类原代细胞（造血干细胞/祖细胞HSPCs及成纤维细胞）中发现，HBG1/2启动子靶向编辑可诱发高频次大片段杂合性缺失（LOH），而DNA-PKcs抑制剂AZD7648会显著加剧该基因毒性。值得注意的是，CDK4/6抑制剂帕博西尼（palbociclib）通过诱导G0/G1期阻滞可有效降低染色体畸变，且不影响HSPCs的长期植入能力。动物实验进一步表明，基因毒性细胞在移植后90天内被清除。该研究为CRISPR基因治疗安全性评估提供了高灵敏度单细胞监控平台，并提出了可行的风险缓解方案。
基因编辑技术CRISPR-Cas9为遗传病治疗带来了革命性希望，然而其诱导的DNA双链断裂（DSB）可能引发靶向基因毒性（ON-target genotoxicity），包括大片段缺失、杂合性缺失（LOH）甚至染色体碎裂（chromothripsis）。这些基因组异常是否会影响细胞功能、能否在体内长期存留，已成为基因治疗安全性的核心关切。传统检测方法如荧光原位杂交（FISH）或批量测序难以在单细胞水平全面捕捉基因毒性事件的异质性，尤其无法区分拷贝数缺失型LOH（CL-LOH）与拷贝数正常型LOH（CN-LOH）。
为解决这一难题，法国波尔多大学Aurélie Bedel和Francois Moreau-Gaudry团队在《Nature Communications》发表研究，开发了一套整合单细胞SNP-DNA测序（scSNP-DNAseq）、微核流式检测及LOH报告系统（FAMReD）的多重分析策略。该技术平台首次实现了对CRISPR编辑后原代细胞基因组稳定性的纵向、单细胞分辨率监测。
关键技术方法概述
研究团队设计了覆盖人类10号与11号染色体高频单核苷酸多态性（SNP）的定制Panel（403个扩增子），通过Tapestri平台进行单细胞DNA测序。利用UMAP聚类和高品质SNP分型，可精准识别 kilobase至megabase尺度的LOH事件，并结合读深分析区分CL-LOH与CN-LOH。实验采用脐带血来源的CD34+造血干细胞/祖细胞（HSPCs）及人工成纤维细胞（hFFs），通过电转递送CRISPR核糖核蛋白（RNP）靶向HBG1/2启动子、UROS或ABRAXAS2基因位点。体内实验通过免疫缺陷小鼠（NSG模型）移植评估编辑细胞的长期存活与基因组稳定性。
scSNP-DNAseq技术验证与LOH定量分析
为建立scSNP-DNAseq的可靠性，团队利用既往开发的FAMReD系统构建了阳性对照细胞系（Chr10q端粒LOH模型）。通过靶向ABRAXAS2的CRISPR编辑，在UROS+/-成纤维细胞中诱导荧光表型转换（因UROS功能等位基因丢失），流式分选后经scSNP-DNAseq确认，>99%的荧光细胞呈现从切割位点至端粒的连续LOH，且SNP丢失模式与预期一致（图1c-e）。该结果验证了技术检测等位基因特异性LOH的灵敏度。
HBG1/2启动子编辑在HSPCs中诱发高频次LOH
靶向HBG1/2启动子（gRNA-68）的CRISPR编辑在HSPCs中主要诱导5 kb缺失，但scSNP-DNAseq揭示了更复杂的基因组重排。通过全SNP集UMAP分析，发现4.6%的细胞在编辑后第4天出现约5 Mb的端粒LOH（Chr11p），其中约70%为缺失型事件（图2b-c）。进一步采用5个高品质SNP（megabasic panel）提升分辨率后，LOH检出率升至7.4%，且新增2.2%的细胞呈现interstitial LOH（iLOH），即仅切割点附近SNP丢失而端粒SNP保留（图3d-h）。Ploidy分析表明，端粒LOH以CL-LOH为主（平均ploidy≈1.2），而interstitial LOH中CL-LOH占比亦超60%。这些数据揭示CRISPR编辑可同时诱发kilobase与megabase尺度的缺失事件。
DNA-PKcs抑制剂AZD7648加剧短期基因毒性
为评估同源定向修复（HDR）增强剂的基因毒性风险，团队测试了CDC7抑制剂XL413与DNA-PKcs抑制剂NU7441、AZD7648。在成纤维细胞中，AZD7648虽提高HDR效率，但显著增加微核形成（0.7% vs 0.16%）及FAMReD检测的端粒LOH（0.6%）（图4a-b）。时序scSNP-DNAseq显示，AZD7648处理组的LOH事件延迟至第7天出现（3.9%），且持续至第20天（1.37%），而对照组LOH在第20天降至0.23%（图4c）。在HSPCs中，AZD7648同样导致微核率升高（3-4%），并使端粒LOH频率增加3倍（约7%），且以CN-LOH为主（ploidy≈1.7-2.0），提示DNA-PKcs抑制通过阻碍非同源末端连接（NHEJ）修复途径，促进染色体截断与LOH的长期存留（图4d-f）。
帕博西尼通过G0/G1阻滞降低基因毒性
基于DSB相关基因毒性多发生于分裂期细胞的假设，团队探索了CDK4/6抑制剂帕博西尼的防护作用。在HSPCs中，帕博西尼（1 μM）处理36小时可使G0/G1期细胞比例升至92%，且不影响编辑效率（图5a-b）。编辑后第2天，帕博西尼将核异常率降低逾2倍（20%→9%），微核率从1.8%降至0.9%（图5c）。scSNP-DNAseq进一步证实，帕博西尼处理24小时即可将总LOH频率从9.2%降至2.9%，其中端粒LOH减少7倍，而interstitial LOH仅降低2倍（图5d）。值得注意的是，当帕博西尼与AZD7648联用时，其保护作用被逆转，表明帕博西尼的基因毒性缓解依赖功能性NHEJ通路。
帕博西尼增强HSPCs植入能力并维持干细胞特性
帕博西尼的细胞周期阻滞是否影响HSPCs功能？研究显示，帕博西尼处理虽短暂抑制细胞增殖，但移植后17周，小鼠骨髓中人造血细胞嵌合率（hCD45+）显著升高（图6c）。极限稀释实验证实，帕博西尼组干细胞重建细胞（SRC）频率提升2.6倍（1/1360 vs 1/3541），且二次移植后仍维持更高植入率（图6d）。表型分析表明，帕博西尼处理36小时可使CD34+/CD38low/CD90+/CD133+干细胞比例从12%增至26%，并上调CXCR4、TAL1、RUNX1等干性基因表达（图6e-f）。在ABRAXAS2编辑模型中，帕博西尼同样提升移植后嵌合率而不影响谱系分化（图6g-h），证明其兼具基因毒性防护与干细胞功能增强的双重作用。
基因毒性事件在长期植入后消失
为评估LOH细胞的体内命运，团队将HBG1/2编辑的HSPCs移植至NSG小鼠。编辑后第4天，scSNP-DNAseq检测到3.6%（无AZD7648）与10.5%（有AZD7648）的细胞携带Chr11p端粒LOH。然而，移植90天后，尽管编辑等位基因仍存在，但LOH细胞完全消失（图7e-f）。这一结果提示，即使在高风险编辑条件下（如AZD7648处理），基因毒性细胞也可能在体内被选择性清除。
结论与展望
本研究通过创新性单细胞多重分析平台，系统揭示了CRISPR-Cas9编辑在原代细胞中诱发的kilobase至megabase尺度LOH事件，并阐明DNA-PKcs抑制剂AZD7648的基因毒性增强效应。更重要的是，研究发现帕博西尼可通过G0/G1期阻滞有效降低染色体畸变，且意外提升HSPCs的植入能力。体内数据进一步表明，基因毒性细胞在长期移植后可能被自然淘汰，为CRISPR治疗安全性提供了乐观证据。该研究建立的scSNP-DNAseq技术有望成为临床级基因编辑产品的质控标准，为优化编辑方案、评估新型编辑器（如碱基编辑器）的安全性提供关键工具。
