热应力通过抵消水蚤（Daphnia magna）增强的抗氧化防御机制，阻碍了其多代累积对氨基甲酸酯的耐受性

《Science of The Total Environment》：Thermal stress precludes the multigenerational build-up of carbamate tolerance in Daphnia magna by offsetting increased antioxidant defenses

气候变化与化学污染对水蚤多代耐受性的温度效应研究，揭示20℃下吡虫啉耐受性增强伴抗氧化基因过氧化酶上调，而25℃抑制耐受性发展。

　　

石本诚|小田真步|秋目智史|藤原千夏|小山彩|富山奈人|大山和敏

日本茨城县常総市化学部残留分析二室，环境毒理学研究所

摘要

持续的气候变化和化学污染是威胁全球生态系统稳定性和生物多样性以及长期环境健康的主要压力因素。在本研究中，我们评估了大型溞（Daphnia magna）在热应激下对化学物质的耐受性，并通过RNA测序确定了与耐化学物质克隆相关的基因。将大型溞连续暴露于两种温度（20°C和25°C）下的亚致死浓度的氨基甲酸酯类杀虫剂吡虫啉（pirimicarb）中，经过15代后，结果显示：在20°C条件下，暴露组的48小时半数有效浓度（EC50）是对照组的两倍，而在25°C条件下两组之间没有差异。因此，高温抑制了大型溞在持续暴露于吡虫啉下的耐受性形成。此外，在25°C条件下，暴露组的生长速率显著低于对照组，而在20°C条件下两组之间没有生长差异。与此一致的是，只有在20°C条件下对吡虫啉具有耐受性的大型溞中，氧化应激相关基因（包括细胞色素P450和过氧化物酶）以及乙酰胆碱酯酶的mRNA水平显著上调。实时定量PCR分析验证了这些结果，表明过氧化物酶可能是吡虫啉耐受性的关键因素。此外，在两种温度下，暴露于吡虫啉的大型溞的甲壳层都比对照组更厚。这些发现强调了温度在多代暴露于杀虫剂的情况下对耐受性建立的重要性。

引言

人类活动（Borgwardt等人，2019年）和气候变化都对水生生态系统和生物体产生了严重的不利影响。随着大气温度的上升，近年来湖泊表面温度也有所增加（Dokulil等人，2021年），温暖的水体改变了湖泊中大型溞的群落组成（Dziuba等人，2020年）。此外，气候变化和人工化学物质的共同作用加速了对各种水生生物（包括枝角类动物）的损害（Knillmann等人，2013年）。Dinh等人（2022年）回顾了多项关于温度升高和污染物对水生无脊椎动物影响的研究，指出金属和杀虫剂等污染物在个体层面常常与温度升高产生协同效应。此外，温度升高或污染物的影响取决于暴露时间和测量的具体生物学指标。例如，一项关于在温暖条件下暴露于铜的大型溞的研究表明，尽管其氧化应激显著增加，但急性毒性却降低了（Bae等人，2016年）。因此，鉴于化学和热应激因素的影响并不总是协同的，需要进一步研究在同时受到热应激的情况下化学物质暴露对水生生物的影响，以便更好地预测温度升高背景下各种有毒化合物的影响。Im等人（2020年）先前发现，通过将大型溞暴露于高温下六代，可以检测到其生活史特征的恢复。因此，多代研究是预测温度升高条件下化学毒性实际影响的重要工具。然而，很少有研究探讨同时受到热应激的水生生物对化学物质暴露的多代效应。

水生生物通常通过多代化学暴露获得化学耐受性。这种耐受性的机制通常涉及由突变基因编码的酶或母体（表观遗传）效应（Benting和Nauen，2004年）。母体效应是指父母通过非直接遗传方式影响后代的表型（Agrelius和Dudycha，2025年），并可能改变生物体对环境污染物的敏感性（Mousseau等人，2009年）。Brausch和Smith（2009年）表明，将大型溞个体暴露于氰氟氰菊酯或萘中12代后，它们会发展出耐受性，而在没有这些化学物质的情况下，这种耐受性会迅速恢复到基线水平，这表明适应是由非遗传机制驱动的。DNA甲基化在引起母体效应方面起作用，因为它可以调节多个基因（Venney等人，2019年）。作者还发现，在处理过的大型溞中存在跨代的DNA高度甲基化传递，且不同代之间的水平存在显著差异。因此，了解化学耐受性的分子机制（如基因表达水平）有助于识别可用于化学应激环境监测的生物标志物。

在本研究中，我们评估了枝角类动物大型溞在无热应激或存在热应激的情况下，经过15代后对杀虫剂的耐受性建立情况。对单个大型溞克隆进行15代的评估确保观察到的耐受性变化可归因于由跨代效应介导的非遗传变化。大型溞是一种常用的化学毒性评估参考物种（OECD，2004年）。吡虫啉是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，也是乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，广泛用于苹果园，并能诱导目标害虫（如蚜虫）产生耐受性。我们假设高温会阻碍大型溞的化学耐受性发展，因为在该物种中，细胞能量分配在高温下显著减少，导致为了生存而增加碳水化合物消耗和氧化应激防御（Samanta等人，2020年），从而减少了适应化学暴露所需的能量。

我们之前已经确定了与大型溞对吡虫啉耐受性相关的几种机制，包括AChE水平升高、抗氧化酶活性（过氧化物酶（POX）和超氧化物歧化酶）增强、ATP结合盒（ABC）转运基因上调以及DNA甲基化（Ishimota等人，2020年、2022年、2024年）。这些发现表明，多代积累的化学耐受性可能是由母体效应驱动的，这可能表现为酶的适应性变化。然而，其他复杂机制也可能有助于耐受性的形成。先前的研究表明，与20°C相比，25°C的水温会增加大型溞的铜诱导氧化应激，并增强镉毒性对种群增长的影响（Bae等人，2016年）。在之前的研究中，我们发现大型溞在20°C下暴露于吡虫啉超过15代后产生了耐受性，这是OECD测试指南推荐的温度（Ishimota等人，2024年；OECD，2004年）。在本研究中，我们评估了大型溞是否不仅在20°C，而且在25°C下经过15代后也能发展出对吡虫啉的耐受性。25°C的温度可能对大型溞来说具有能量压力。我们通过进行48小时急性固定试验来确定F14代的半数有效浓度（EC50），并使用21天慢性生命周期试验计算内在生长速率（r）。此外，我们对F14代的新生个体进行了RNA测序（RNA-seq），并识别出与化学耐受性相关的基因本体（GO）术语。我们还评估了F14代大型溞的甲壳层厚度，因为角质层增厚可以增强蚊子等昆虫的杀虫剂耐受性（Wood等人，2010年）。我们的发现强调了温度在枝角类动物化学耐受性建立中的重要性，并强调了在评估水生生物化学暴露风险时考虑热应激的必要性。

部分摘要

大型溞培养

我们于2010年从日本茨城县的国家环境研究所（NIES）获得了一个大型溞克隆，并在Elendt M4培养基（Elendt和Bias，1990年）中在实验室中维持该克隆。该克隆的后代在100毫升的培养基中培养于100毫升的玻璃烧杯中，并制备了重复培养物。培养基每周更换超过三次。藻类食物为普通小球藻（Chlorella vulgaris，Recenttec K.K，东京，日本），浓度为5×10^5个/毫升。

测试水中的吡虫啉浓度和水质参数

在20°C和25°C长期适应期间，平均水温分别为20.2°C和25.6°C。在25°C下暴露48小时后，吡虫啉的平均回收率和RSD分别为81-92%和1.5-13.1%，其稳定性和RSD均在我们的目标范围内（回收率：70-120%；RSD：<20%）。此外，在急性固定试验中，20°C条件下测试水中测得的吡虫啉浓度与标称浓度的比率在92%之间。

升温对F14代吡虫啉对照组的影响

F14代对照组在25°C下连续培养时的种群生长速率（r值）高于20°C下的生长速率，表明在较高温度条件下生长趋势增强。这一发现与之前对另一种枝角类动物Moina macrocopa的研究结果一致，该物种在25°C下的繁殖率高于20°C（Gama-Flores等人，2015年）。相比之下，升温降低了体内的脂肪和糖含量。

结论

大型溞在多代暴露于该化学物质的情况下（F0-F14代）在较低温度（20°C）下发展出了对吡虫啉的耐受性。然而，在较高温度（25°C）下暴露的组没有发展出耐受性。种群生长速率也表现出在20°C下耐受性的建立模式，而在25°C下则没有。RNA-seq和RT-qPCR分析的结果表明，这种化学耐受性是由抗氧化酶基因（POX）表达增强引起的。

CRediT作者贡献声明

石本诚：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法论设计、实验研究、数据分析、概念化。 小田真步：写作 – 审稿与编辑。 秋目智史：验证、方法论设计、实验研究。 藤原千夏：写作 – 审稿与编辑、验证、方法论设计、实验研究。 小山彩：写作 – 审稿与编辑。 富山奈人：

资金来源

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。

利益冲突声明

我们没有需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢Novogene有限公司进行了RNA-seq实验，以及高桥直文博士委托了解剖实验。同时感谢我们的技术人员北原彩在实验中提供的支持。我们还感谢Editage（https://www.editage.com/）对手稿的英文编辑。

术语表

AChE

乙酰胆碱酯酶

EC50

半数有效浓度

GLM

广义线性模型

mRNA

信使核糖核酸

OECD

经济合作与发展组织

qPCR

定量聚合酶链反应

RNA-seq

RNA测序

RSD

相对标准偏差