《Cell Reports》：Human liver cholangiocyte organoids capture the heterogeneity of in vivo liver ductal epithelium
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本研究针对传统人肝胆管类器官模型无法再现体内胆管上皮细胞异质性这一关键问题，通过优化培养条件成功开发出能够同时捕获胆管细胞、双潜能祖细胞和肝细胞样状态的类器官系统。研究发现WNT信号抑制可促进胆管细胞向肝细胞样状态分化，该模型为研究人类胆管细胞可塑性、分化和疾病机制提供了重要平台，对肝脏再生医学和药物毒性评估具有重大意义。
肝脏作为人体重要的代谢器官，其功能主要由两种上皮细胞承担：肝细胞(hepatocytes)负责大部分代谢功能，胆管细胞(cholangiocytes)则参与胆汁的修饰和排泄。在慢性肝病中，当肝细胞再生能力受损时，胆管细胞能够增殖并分化为新的肝细胞和胆管细胞，从而参与组织修复。然而，人类胆管上皮细胞在体内具有高度的异质性，包括胆管细胞定向、双潜能(bipotent)和肝细胞样(hepatocyte-like)等多种细胞状态。由于缺乏能够准确模拟这种异质性的体外模型，这些细胞状态之间的关系及其在肝脏维持、再生和疾病中的作用机制一直未被充分理解。
传统的人肝胆管类器官培养体系虽然能够长期扩增，但研究表明这些类器官在细胞状态上相当均一，缺乏体内胆管上皮的复杂异质性。为了突破这一局限，来自马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所的Javier Bregante、Flaminia Kaluthantrige Don和Meritxell Huch等研究人员开展了一项创新性研究，通过模拟体内微环境信号优化培养条件，成功开发出能够全面捕获人类胆管上皮细胞异质性的新型类器官模型。该研究成果发表在《Cell Reports》期刊上。
研究人员主要采用了单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术、类器官培养与分化实验、功能验证实验以及计算生物学分析方法。他们从23名40-76岁患者的手术切除肝组织中分离EpCAM+胆管细胞，通过优化培养基成分（增加WNT和FGF信号，去除forskolin）建立了新型类器官培养体系。通过免疫荧光染色、qRT-PCR、电子显微镜和功能性测定（如白蛋白分泌、细胞色素P450活性检测）等多重技术手段，全面评估了类器官的形态、基因表达和功能特征。特别利用CellChat等算法进行细胞间通信分析，并与人类肝脏单细胞图谱数据进行比较验证。
refined胆管类器官捕获人肝胆管上皮的异质性
研究人员发现，传统培养基中培养的胆管类器官仅包含两种主要亚群，两者仅在于增殖状态不同（MKI67+/TOP2A+），而缺乏双潜能和肝细胞样状态。通过优化培养基成分，研究人员成功建立了新型类器官系统（refined medium），这些类器官形成致密结构，表达胆管细胞标志物（KRT19、KRT7、EPCAM）的同时，也高表达肝细胞标志物（HNF4A、ALB、CYP3A4）。单细胞RNA测序分析显示，新型类器官包含六个不同的细胞状态，可分为三大类：三个胆管细胞定向群体（mDC_1、DC_2、cDC_3）、两个双潜能祖细胞群体（BiDCp_1、BiDCp_2）和一个肝细胞样群体（HepDC）。这些细胞状态与人类肝脏体内单细胞图谱高度相似，特别是BiDCp_2群体与已知的DUOX2+/ACE2+双潜能群体高度一致。
胆管细胞通过双潜能状态向肝细胞样状态转变
轨迹推断分析（RNA velocity、扩散分析、Monocle3和PAGA）表明，在新型类器官中，胆管细胞通过双潜能中间状态向肝细胞样状态分化。通路活性分析显示，WNT信号通路在这一转变过程中发挥关键作用：胆管细胞定向状态表现出较高的WNT活性，而双潜能和肝细胞样状态中WNT活性显著降低。研究人员通过体外实验证实，从培养基中去除WNT条件培养基可显著提高肝细胞标志物（ALB、CYP3A4）的表达水平。
WNT抑制增强向肝细胞命运的分化
基于上述发现，研究人员开发了改进的分化方案（DM+），在分化阶段加入WNT抑制剂（iCRT3和IWP2）。与传统分化方案相比，DM+处理后的类器官表现出更强的肝细胞功能，包括白蛋白分泌增加、CYP3A4和CYP2C9活性升高。单细胞RNA测序分析显示，DM+处理后肝细胞样群体的比例从4.9%显著增加至42.7%，并进一步细分为四个功能特化的亚群。此外，这些肝细胞样状态对药物性肝损伤（DILI）化合物（如胺碘酮和环孢素A）表现出特异性易感性，形成了典型的层状体和脂滴积累。
本研究成功建立了能够准确模拟人类胆管上皮细胞异质性的新型类器官模型，解决了传统模型细胞状态单一的关键局限。这一平台不仅为研究胆管细胞可塑性、胆管-肝细胞分化机制提供了强大工具，而且能够用于评估药物对胆管来源肝细胞样细胞的毒性效应，拓宽了体外肝脏模型的应用范围。该研究揭示了WNT信号在胆管细胞状态调控中的双重作用：初期激活促进双潜能状态形成，而后期抑制则有利于肝细胞命运决定。这一发现为理解肝脏再生中的细胞命运决定机制提供了重要见解。未来，这一模型有望应用于慢性肝病研究，帮助揭示疾病状态下胆管细胞异质性的变化及其在疾病进展中的作用。
