《Toxics》：Quantification of Pharmaceuticals in Sludge Produced from Wastewater Treatment Plants in Jordan and Environmental Risk Assessment
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本研究首次通过膳食暴露途径系统评估了草甘膦（GLY）在斑马鱼雌鱼中的内分泌干扰效应。结果表明，即使暴露于欧洲食品安全局（EFSA）认定的安全剂量（ADI为0.5 mg/kg/天，NOAEL为50 mg/kg/天），GLY仍能通过诱导肝糖原积累、铁死亡应激（ferroptosis）和雌激素受体（esr）信号通路紊乱，以非单调剂量效应方式损害卵母细胞基因表达（bmp15, ccnb1）和受精能力，凸显了重新评估GLY女性生殖风险的必要性。
引言
自1974年作为除草剂投入使用以来，草甘膦（GLY）因其通过抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）特异性影响植物和细菌的芳香氨基酸合成，曾被认为对非靶标生物风险较低。然而，越来越多的证据表明GLY对水生生物具有广泛毒性，并被怀疑为潜在的内分泌干扰物（EDC）。国际癌症研究机构（IARC）于2015年将其归类为2A类（对人类可能致癌）。鉴于其在环境介质和食品中的广泛存在，欧洲食品安全局（EFSA）设定了GLY的每日允许摄入量（ADI）为0.5 mg/kg体重，未观察到 adverse 效应水平（NOAEL）为50 mg/kg体重。肝脏作为代谢和解毒的关键器官，是GLY毒性的重要靶点，其功能紊乱可能通过肝-性腺轴影响生殖健康。本研究假设膳食暴露于EFSA认定的“安全”剂量GLY，仍可能通过扰乱肝-性腺轴导致雌性斑马鱼肝毒性和生殖毒性。为验证此假设，研究采用不含表面活性剂的纯GLY，通过膳食途径暴露成年雌性斑马鱼21天，以模拟真实环境暴露场景。
材料与方法
动物维护与GLY暴露
成年雌性斑马鱼（AB野生型）随机分为四组：对照组（CTRL）和三个GLY暴露组（GLY0.5， ADI剂量；GLY5；GLY50， NOAEL剂量）。对照组饲喂标准商业干饲料，处理组饲喂添加相应剂量GLY的相同饲料。暴露在27°C、光周期10小时光照/14小时黑暗的半静态条件下独立进行三次。实验结束后，记录体重，采集肝脏和性腺组织，计算肝体指数（HSI）和性腺指数（GSI），组织样本用于后续组织学、免疫组化和基因表达分析。
全身及饲养水GLY浓度分析
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）在多反应监测（MRM）模式下分析鱼体匀浆和水中GLY浓度。色谱分离使用C18柱，以水和甲醇为流动相进行梯度洗脱。质谱分析使用电喷雾电离（ESI）源和三重四极杆（QqQ）质量分析器。
肝脏和性腺组织学及免疫组化评价
肝脏和性腺组织经Bouin's液固定，石蜡包埋后切片。肝切片进行苏木精-伊红（H&E）染色评估脂质积累，过碘酸-雪夫（PAS）染色评估糖原含量。卵巢切片H&E染色进行形态学评估，并统计不同卵泡期（卵黄发生前、卵黄发生、成熟中、闭锁）百分比。免疫组化检测肝脏中xCT/SLC7A11、DMT1/SLC11A2、Keap1蛋白表达，以及卵巢中DDX4和PCNA表达。
基因表达分析
分离不同发育阶段卵泡，提取总RNA并反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析肝脏中卵黄蛋白原（vtg）亚型（vtg1-vtg7）和雌激素受体（esr1, esr2a, esr2b）基因，以及卵泡中与卵子发生相关基因（bmp15, ccnb1, lhcgr等）的表达。基因表达数据以rpl13a和rplp0为内参基因，采用2–ΔCt法计算。
血浆激素测定
血浆样本经蛋白沉淀后，采用LC-MRM/MS分析孕酮、雌二醇、皮质醇和皮质酮水平。
受精率评估及胚胎存活和孵化率测定
在暴露第14至21天，将GLY暴露雌鱼与未暴露雄鱼配对，评估受精卵数量、胚胎死亡率（3.3小时受精后，hpf）和孵化率（72 hpf）。
统计分析
使用GraphPad Prism进行统计分析。正态分布数据采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，非正态分布数据采用Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验。显著性水平设定为p < 0.05。
结果
GLY浓度
全身GLY分析显示剂量依赖性积累，GLY50组达到最高。饲养水中GLY浓度低于检测限，表明无GLY从饲料中浸出。
GLY对肝体指数和肝脏组织学及免疫组化的影响
GLY5组HSI显著升高。组织学显示GLY未改变肝脏脂质积累，但GLY5和GLY50组肝糖原储存增加。免疫组化显示，GLY0.5和GLY50组Slc7a11水平非单调性升高，GLY50组Slc11a2水平显著升高，所有GLY暴露组Keap1水平有升高趋势但不显著。
GLY对性腺指数和卵巢组织学及免疫组化的影响
各暴露组GSI与对照组无显著差异。卵泡类型分布和DDX4水平在各组间均无显著变化，尽管GLY0.5组DDX4有下降趋势。
GLY对卵子发生、类固醇生成和生育力的影响
基因表达分析显示，在肝脏中，GLY0.5组下调vtg3, vtg4, vtg7和esr1；GLY5组仅下调esr1；GLY50组显著下调vtg1–vtg5, esr1和esr2a。在卵黄发生卵泡中，GLY0.5组下调esr2b, bmp15和ccnb1；GLY5组下调esr2b；GLY50组上调lhcgr, esr1和esr2a。在成熟中卵泡中，仅GLY50组下调bmp15和ccnb1。血浆激素分析显示，仅GLY50组孕酮、雌二醇、皮质醇和皮质酮水平显著升高。生育力结果因剂量而异：GLY0.5组受精卵数量增加，GLY50组受精率降低，GLY5组受精率未变但胚胎死亡率显著增加。胚胎孵化率未受显著影响。
讨论
本研究揭示了膳食GLY对雌性斑马鱼肝-性腺轴的剂量依赖性干扰。最高剂量（GLY50， NOAEL）引起最显著的扰动，表现为慢性应激（皮质醇和皮质酮升高）、肝糖原积累、铁死亡应激标志物（Slc7a11, Slc11a2）改变、雌激素受体信号通路和卵黄蛋白原合成抑制，以及卵母细胞成熟相关基因（bmp15, ccnb1）下调，最终导致受精率下降。这表明GLY50主要损害配子质量而非卵泡发育。最低剂量（GLY0.5， ADI）也触发了卵子发生关键基因的改变，但受精卵数量反而增加，可能是一种低剂量毒物兴奋效应（hormesis）或补偿机制。中间剂量（GLY5）引起肝代谢改变和卵巢雌激素受体下调，虽不影响受精率，但导致胚胎死亡率升高，提示其对配子或早期胚胎发育存在潜在损害。GLY50诱导的肝内铁死亡应激与激素紊乱（孕酮升高可能促铁死亡，雌二醇升高可能起保护作用）相互交织，共同导致了生殖功能衰退。这些发现表明，即使暴露于当前监管标准认为安全的剂量，GLY仍能以非单调方式破坏肝脏代谢、内分泌信号和雌性生殖功能，强调了在生态风险评估中考虑非线性剂量反应关系和性别特异性生殖风险的重要性。
结论
本研究证实膳食暴露GLY可通过扰乱雌性斑马鱼肝-性腺轴，以剂量特异性方式诱导肝代谢紊乱、内分泌信号干扰和生殖毒性。低剂量可能通过补偿机制暂时增强繁殖，而高剂量则压倒防御机制导致繁殖失败。研究结果凸显了GLY生殖毒性的复杂性，以及在水生生态系统风险评价中重新审视现行GLY安全阈值的必要性。
补充材料
补充材料提供了GLY分析的相关数据和色谱图。
