近红外光控DNA镊子实现可逆miRNA识别与信号擦除用于活体连续成像

《SCIENCE ADVANCES》：NIR-switched DNA tweezer enables reversible miRNA recognition with erasable signal for in vivo continuous imaging

本文报道了一种近红外光控DNA镊子(NIR-DNA tweezer)，通过上转换纳米颗粒(UCNPs)将808 nm近红外光转换为紫外/可见光，调控偶氮苯(Azo)的光异构化，实现对miRNA-21的可逆识别与信号擦除。该技术解决了现有miRNA成像探针响应不可逆、无法实时追踪浓度波动的难题，为活体动态监测核酸标志物表达波动提供了新方法。

　　

在生命科学和医学研究领域，microRNAs（miRNAs）作为重要的基因表达调控因子，其浓度和分布与多种生物过程密切相关，包括疾病发生发展、机体对抗癌药物的反应等。然而，miRNAs的表达具有高度动态性，在生理条件变化时可在短时间内出现显著波动。例如，在脑缺血过程中，miR-1264/1298/448的表达会在再灌注初期150分钟内快速上升，随后在24小时内下降；心肌梗死初期（0-6小时），miR-30d-5p/miR-125b-5p会显著增强，24小时后逐渐降低。这种动态表达模式使得实时连续追踪miRNA浓度波动对于研究疾病发展和治疗过程至关重要。

尽管基于响应性核酸结构和杂交策略的miRNA成像技术取得了显著进展，但现有探针普遍存在不可逆响应的局限性。一旦产生信号，就无法实时擦除，导致信号随miRNA表达升高而增加，却无法随浓度下降而实时减弱。这种"一次性"检测模式使得原位连续追踪miRNA表达波动变得困难。虽然体内信号最终会随着探针代谢而减弱，但这是一个不受控的过程，通常远滞后于miRNA表达的自然下降。

设计对靶标具有可逆结合亲和力的识别探针是连续追踪浓度波动的关键。DNA通过Watson-Crick碱基配对具有高度可配置性，其自组装结构非常适合这一目的。通过引入与识别链竞争靶分子的诱导链，可以释放靶标并更新识别链。然而，多次测量需要重复额外添加诱导链，这既费时费力又影响体内应用。

光控操作通过非侵入方式提供高时空控制，成为DNA构型操纵的有吸引力且有效的途径。偶氮苯（Azo）及其类似的光开关分子在不同波长光交替照射下发生光异构化，已被用于DNA链的构型控制和生物功能操纵。通过将识别链和竞争链与Azo修饰的连接链连接，已成功开发出光可逆DNA探针用于ATP和凝血酶的检测。

本研究将光可逆探针的检测目标从小分子扩展到核酸。以miRNA-21（miR-21）为例，其表达波动与肿瘤进展相关并反映不同药物效果，考虑到其约21 bp的识别区域，需要更广泛地调节其与识别探针的结合亲和力才能实现可逆检测。因此，本研究直接调节识别/竞争链的杂交区域，而不是调节连接链构型来实现可逆miR-21检测。

研究人员设计了一种近红外光控DNA镊子（NIR-DNA tweezer），通过对808 nm近红外光功率密度的调节，实现对miRNA-21的可逆识别与信号擦除。该探针由自淬灭的DNA镊子与上转换纳米颗粒（UCNPs）结合而成，其中DNA镊子包含BHQ3标记的miRNA识别链和Cy5标记的竞争链，竞争链中嵌入偶氮苯（Azo）用于光控DNA镊子的杂交区域。

关键技术方法包括：1）设计光开关DNA镊子结构，通过Azo异构化调控杂交状态；2）合成多层结构上转换纳米颗粒（NaYF₄:Tm,Yb@NaYF₄:Yb,Nd@NaYF₄:Nd），实现808 nm激发下的功率密度可控UV/Vis上转换发射；3）利用点击化学将DNA镊子与功能化UCNPs偶联；4）通过荧光共振能量转移（FRET）和分子动力学（MD）模拟验证结合亲和力切换机制；5）建立活体连续成像方案，通过交替高低功率808 nm照射实现信号采集与擦除。

光开关DNA镊子的设计与表征

研究人员合成了由miR-21识别探针（R-DNA）和竞争探针（C-DNA_Azo）组成的DNA镊子。C-DNA_Azo的开关区域中交替掺入了四个Azo分子，通过交替UV/Vis照射可逆调控Azo的异构化。凝胶电泳和UV/Vis光谱证实了DNA镊子的成功合成和Azo的高效异构化转换。分子动力学模拟显示，闭环DNA镊子的相互作用能为-591.5±6.0 kcal/mol，过渡态为-542.9±7.4 kcal/mol，开环态为-579.7±4.8 kcal/mol，证实了光控状态转换的能量可行性。

光开关DNA镊子对miRNA的可逆响应

通过FRET结合实验评估DNA镊子对miR-21的可逆结合亲和力。UV照射诱导DNA镊子处于过渡态，部分暴露miR-21识别区域，赋予其高结合亲和力（K_d≈21.74 nM）；而Vis照射诱导闭环状态，降低miR-21结合亲和力至约1880 nM，结合亲和力差异超过80倍。荧光动力学分析显示，UV照射后miR-21结合在约20分钟内达到荧光饱和，随后Vis照射在20分钟内有效释放miR-21并淬灭荧光。

功率密度切换的NIR-DNA镊子用于可逆miRNA检测

研究人员合成了多层结构UCNPs，通过调节808 nm激发功率密度控制上转换发射的UV/Vis比例。低功率（0.028 W）时可见光发射占主导（I_Vis/I_UV=3.06），高功率（1.16 W）时UV发射增强（I_Vis/I_UV=1.39）。将DNA镊子与UCNPs-DBCO/FA偶联制备NIR-DNA镊子，每个颗粒表面覆盖约132个DNA镊子。交替高低功率808 nm照射可实现三次循环的可逆荧光恢复与淬灭，检测线性范围为0.2-2.0 nM，检测限为92.3 pM，且对miR-155、miR-205、miR-375和单碱基错配miRNA-21（M1）具有良好特异性。

NIR-DNA镊子用于细胞内动态miRNA成像

细胞实验表明，NIR-DNA镊子在200 μg/ml浓度和高（2 W/cm²）/低（0.75 W/cm²）功率密度808 nm照射下均显示高于93%的细胞活性。细胞内递送实验证实探针在9小时实现有效内化，11-12小时完成内体逃逸。交替高低功率808 nm照射可实现细胞内Cy3荧光的可逆恢复与淬灭，第二次高功率照射恢复96.5%的荧光强度，表明良好的可逆性。

通过转染miR-21模拟物和抑制剂调控细胞内miR-21表达，NIR-DNA镊子成功追踪到表达波动：miR-21模拟物处理使荧光强度增强1.86倍，后续抑制剂处理使荧光强度抑制至16.61%。qRT-PCR验证了类似的表达变化趋势（1.58倍增强和13.90%抑制）。药物处理实验显示，5-FU（10 μM）处理使miR-21表达上调1.75倍，而CIB-3b（10 μM）处理使表达下调至52.21%，与PCR结果一致。

NIR-DNA镊子用于活体连续miRNA成像

在荷HeLa瘤小鼠模型中，静脉注射的NIR-DNA镊子_Cy5/BHQ3在7小时后在肿瘤部位达到最大积累。通过瘤内注射agomir（miR-21模拟物）和antiagomir（miR-21抑制剂）调控肿瘤miR-21表达，交替高低功率808 nm照射可实现活体连续成像。高功率照射后agomir处理组显示明显Cy5/UCNPs比率荧光信号，而后续antiagomir处理组信号显著降低。实验期间肿瘤组织温度在33.5-37.5°C之间波动，处于正常生理范围，未造成组织损伤。主要器官的组织病理学分析显示与未处理对照组相比无明显病变，证实成像探针的良好生物相容性。

研究结论与意义

本研究开发的NIR-DNA镊子通过光控可逆结合miR-21，实现了在连续化疗药物和抑制剂处理下活体追踪miRNA表达波动。与针对小分子的DNA探针不同，针对具有约21 bp识别区域的miRNA，需要更广泛地调节结合亲和力。通过直接调节识别/竞争链的杂交区域而非连接链构型，实现了约80倍的结合亲和力差异，远大于先前报道的可逆检测探针的切换范围。

该技术通过808 nm近红外光功率密度调节实现对Azo异构化的精确控制，避免了紫外-可见光的浅组织穿透性和光毒性问题。虽然DNA双链的稳定性可能导致相对较慢的Azo异构化速率，但药物或抑制剂处理引起的miRNA表达变化通常需要数小时，为NIR-DNA镊子结合亲和力切换提供了足够时间。使用低热效应的808 nm照射光作为刺激物驱动结合亲和力转换，以及在照射期间添加"光熄"间隔，有助于减少光照射过程对机体的损伤。

这项工作为活体动态成像核酸生物标志物和疾病治疗诊断提供了潜在应用，通过可逆信号生成与擦除机制，克服了传统不可逆探针在追踪表达下调时产生假阳性信号的局限性，为理解疾病进程和恢复评估提供了有力工具。