《SCIENCE ADVANCES》：Basis for lineage-determining pioneer factors targeting distinct repressed chromatin states
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本研究针对先驱转录因子如何识别异质性沉默染色质这一关键科学问题，系统比较了13种发育转录因子的染色质靶向特性。研究发现，DNA结合域（DBD）类型可预测先驱因子靶向紧凑染色质中低周转核小体的能力，而非DBD结构域则赋予其靶向H3K9me3或H3K27me3标记的异染色质的能力。通过构建SOX2与非DBD结构域的融合蛋白，成功扩展了SOX2在异染色质中的结合范围并改善了细胞重编程效率。该研究发表于《Science Advances》，揭示了谱系决定因子协同靶向不同形式沉默染色质的机制，为理解细胞命运转变提供了新见解。
在生命科学的宏伟蓝图中，细胞如何从一种身份转变为另一种身份，即细胞命运决定，是一个核心谜题。这一过程对于胚胎发育、组织再生乃至疾病治疗都至关重要。而在这个转变过程中，有一类特殊的“开路先锋”——先驱转录因子（Pioneer transcription factors），它们拥有一种令人惊叹的能力：能够结合到转录沉默的、紧密压缩的染色质区域，为后续的基因激活事件“打开大门”。然而，科学家们逐渐意识到，所谓的“沉默染色质”并非铁板一块，它内部存在着高度的异质性。有些区域核小体结构稳定，不易更替；有些则相对动态；还有些区域被特定的抑制性组蛋白修饰所标记，例如由多梳蛋白复合物（Polycomb）介导的H3K27me3修饰，或者由HP1蛋白介导的H3K9me3修饰形成的异染色质（Heterochromatin）。一个悬而未决的关键问题是：面对这些不同的染色质“路障”，不同的先驱因子是如何各显神通，特异性识别并克服这些障碍的？这背后的分子基础是什么？为了回答这个问题，研究人员在《Science Advances》上发表了他们的最新研究成果。
为了系统揭示先驱因子靶向不同沉默染色质状态的分子基础，研究人员运用了几项关键的技术方法。他们首先在原发性人BJ成纤维细胞中，通过Tet-On慢病毒载体系统，以可比较的生理水平异位表达了13种涉及早期哺乳动物发育的转录因子，并利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术绘制了每个因子在全基因组范围内的结合图谱。为了评估染色质的动态特性，他们使用了组蛋白H2B短期脉冲标记（6小时）的方法来测量核小体周转率。此外，他们还整合分析了多种染色质特征数据，包括DNase I超敏位点测序（DNase-seq）、微球菌核酸酶测序（MNase-seq）以及H3K9me3和H3K27me3等组蛋白修饰的ChIP-seq数据，以全面定义不同的染色质状态。通过生物信息学工具（如monaLisa、HOMER、ChromHMM）对海量数据进行分析，比较了不同因子结合位点的染色质特征。最后，他们通过蛋白质工程手段，构建了SOX2与其他因子非DBD结构域的融合蛋白，并再次利用ChIP-seq和诱导多能干细胞（iPSC）重编程实验，验证了非DBD结构域在调控染色质靶向性和细胞命运转变中的功能。
DNA结合域结构预测先驱因子核小体靶向
研究人员系统比较了13种发育转录因子在成纤维细胞中异位表达48小时后的染色质靶向情况。通过ChIP-seq分析，他们发现转录因子靶向DNase抗性（封闭）染色质的能力存在一个连续谱，从高达70.6%到低至8.7%。重要的是，这种靶向能力与转录因子的DNA结合域（DBD）类型密切相关。具有螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix）结构并带有额外DNA接触片段的DBD的因子，如FOXA1、PAX7和PAX3，表现出最强的封闭染色质靶向能力，是典型的强效先驱因子。而高迁移率族（High mobility group）因子SOX2和TCF-1、碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）因子ASCL1和EBF1，以及GATA4和EOMES则显示出中等水平的先驱活性。相比之下，尽管RUNX1、PDX1以及核受体ESRRB和HNF4A在发育中很重要，但它们主要靶向DNase可及的开放染色质，属于非先驱因子。进一步通过组蛋白H2B脉冲标记（6h H2B）分析核小体周转率发现，强效先驱因子倾向于靶向封闭染色质中低周转率的稳定核小体，而EBF1、EOMES等因子则倾向于靶向动态性较高的核小体。非先驱因子则几乎只靶向高周转率的开放染色质区域。序列分析表明，先驱因子在封闭染色质的结合主要由其特异性识别基序驱动，而非通过与其他序列特异性因子协作。
先驱因子采用不同的异染色质靶向模式
研究人员进一步探究了先驱因子如何与H3K9me3和H3K27me3标记的异染色质相互作用。结果显示，先驱因子确实能够靶向这些传统的抑制性染色质域，但方式各不相同。根据结合位点局部异染色质标记的富集程度，可以将先驱因子的靶向模式分为三类：ASCL1、ESRRB、EOMES和EBF1倾向于靶向异染色质标记高度富集的区域；GATA4和TCF-1靶向的位点其异染色质标记水平与周围区域相当，表明它们不受异染色质的明显阻碍；而FOXA1、PAX7、PAX3和SOX2则主要靶向广阔异染色质域中局部标记被耗尽的“缺口”区域。结合核小体周转数据，研究人员发现靶向高密度异染色质的因子（如ESRRB、EOMES、EBF1）同时偏好结合动态性较高的核小体，并且这些位点富含组蛋白变体H2A.Z和H3.3。而靶向异染色质“缺口”的因子（如FOXA1、PAX3）则结合更稳定、更“朴素”的低周转核小体。
非DBD结构域可转移异染色质靶向能力
既然非DBD结构域已知能影响转录因子的功能，研究人员想知道是否可以通过交换这些结构域来“重编程”先驱因子的靶向偏好。他们将能够有效靶向异染色质的转录因子（TCF-1或ESRRB）的非DBD结构域，与SOX2进行融合，构建了杂交蛋白（例如ntTCF1-SOX2和SOX2-ctESRRB）。ChIP-seq分析表明，这些杂交蛋白显著扩展了SOX2的染色质结合范围。特别是，融合了TCF-1 N端结构域的ntTCF1-SOX2在保留野生型SOX2绝大多数结合位点的同时，额外获得了大量位于DNase抗性染色质和中等密度异染色质的新结合位点。而融合了ESRRB C端结构域的SOX2-ctESRRB则表现出不同的行为：它获得了大量新的结合位点（许多在开放染色质），但同时也丢失了许多SOX2原有的靶点，其新结合的异染色质位点特征与野生型ESRRB相似，富含H2A.Z和H3.3。重要的是，这些杂交蛋白仍然特异性识别SOX2的DNA结合基序，表明非DBD结构域主要影响的是染色质搜索和结合稳定性的过程，而非DNA结合特异性。对照实验表明，单独的TCF-1非DBD结构域或仅融合SOX2的DBD结构域都不足以有效靶向封闭染色质，强调了全长SOX2及其非DBD结构域在异染色质靶向中的必要性。
非DBD结构域在全基因组范围内调节先驱因子结合亲和力
通过分析SOX2在其全基因组所有潜在结合基序上的ChIP-seq信号，研究人员发现野生型SOX2仅在其约3%的基序上形成强结合（称为“结合”），但在约34%的基序上存在特异性的、低水平的“采样”（sampling）信号，这反映了转录因子在基因组上的短暂停留。杂交因子ntTCF1-SOX2和SOX2-ctESRRB特异性地结合和采样同一套SOX2基序，但它们改变了结合/采样的模式。ntTCF1-SOX2增加了基序的结合比例，同时也提高了采样范围。而SOX2-ctESRRB虽然也增加了结合比例，但却损害了采样能力。几乎所有的杂交蛋白新获得结合位点都来源于野生型SOX2曾经“采样”的位点。利用染色质状态模型进一步分析发现，ntTCF1-SOX2增强了对H3K27me3和中等H3K9me3标记区域的结合和采样，而SOX2-ctESRRB则显著增强了对高密度H3K9me3和H3K27me3位点的结合，但代价是失去了对“朴素”染色质的结合能力。这表明非DBD结构域能够精细调控先驱因子在不同染色质状态下与其目标基序的结合稳定性。
杂交先驱因子改善多能性重编程
最后，研究人员测试了这些杂交SOX2蛋白在诱导多能干细胞（iPSC）重编程中的功能。在经典的OKM（OCT4, KLF4, c-MYC）加SOX2的重编程体系中，用ntTCF1-SOX2替代野生型SOX2，在第9天能产生比对照组多63%的碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）阳性多能性克隆。并且这些克隆在撤除诱导剂多西环素（doxycycline）后能够维持。相反，使用SOX2-ctESRRB则导致多能性克隆数量减少61%，且形成的克隆无法在撤除诱导剂后维持，表明其重编程效率低下。基因本体论（Gene Ontology）分析显示，ntTCF1-SOX2在成纤维细胞中额外获得了许多在胚胎干细胞（ESC）中由SOX2调控的、与代谢相关的基因靶点，而SOX2-ctESRRB则偏向于获得发育相关基因靶点，但丢失了代谢基因靶点。这解释了为何ntTCF1-SOX2能更有效地重编程细胞，因为它能更全面地靶向多能性网络所需的基因。
研究结论与意义
本研究系统地揭示了发育转录因子靶向不同沉默染色质状态的分子逻辑。研究发现，先驱因子并非采用单一模式，而是展现出靶向从“朴素”低信号染色质到高度浓缩的H3K9me3/H3K27me3异染色质的广泛能力，并且这种能力与其DBD结构域类型密切相关，决定了其核小体结合的基本特性。更为重要的是，非DBD结构域扮演了“染色质状态感受器”的角色，能够指导转录因子偏好性地结合特定动态特性或组蛋白修饰标记的染色质区域。通过蛋白质工程将不同的非DBD结构域与SOX2融合，成功实现了对其染色质靶向范围的“重编程”，并改善了其诱导细胞命运转变的效率，这证明了非DBD结构域功能的可转移性。这项研究不仅深化了对先驱因子工作原理的理解，揭示了它们如何协同克服维持细胞身份的多样染色质屏障，也为未来设计合成转录因子、精准操控细胞命运用于再生医学和疾病治疗提供了重要的理论依据和新的技术途径。
