整合分类学揭示近缘独居蜂种界限：Pachymenes ater与P. ghilianii（膜翅目：胡蜂科：蜾蠃亚科）的系统界定与形态分子证据
《Insects》：Integrative Taxonomy Clarifies Species Limits in Two Closely Related Solitary Wasps: Pachymenes ater and Pachymenes ghilianii (Hymenoptera: Vespidae: Eumeninae)
整合分类学澄清两个近缘独居蜂的物种界限：Pachymenes ater和Pachymenes ghilianii（膜翅目：胡蜂科：蜾蠃亚科）
引言
在形态保守的类群中，物种界定对传统分类学提出了重大挑战。在新热带区的独居蜂属Pachymenes（膜翅目：胡pidae：蜾蠃亚科Eumeninae）中，两个推测的姐妹种——Pachymenes ater和P. ghilianii——历史上仅通过一组有限的、模糊的形态特征来区分，这些特征常常因种内变异和重叠的地理分布而复杂化。整合分类学已发展成为物种界定的强大框架，倡导使用多种互补的数据源以做出更准确的分类学决策。尽管存在方法和后勤上的挑战，整合分类学近年来已获得显著关注。在Hexapoda中，针对膜翅目Hymenoptera的研究占据了整合分类学文献的很大一部分。一些研究特别令人关注，它们将整合方法应用于胡蜂科Vespidae。然而，该科内的许多谱系，包括蜾蠃亚科Eumeninae，从这一角度仍然研究不足。
Pachymenes de Saussure属是新热带区的一个独居蜂类群，在巴西从大西洋森林碎片、高地区域和塞拉多都有报道。近年来对Pachymenes进行了全面的分类学修订，承认了18个有效种并提出了系统发育假说。在其处理中，作者不鼓励承认亚种，这与早期仅基于胡蜂体色来划分种下单元的观点一致。尽管他们的研究澄清了属内物种关系，但某些分类学问题仍未解决。其中一个案例涉及Pachymenes ater de Saussure和Pachymenes ghilianii (Spinola)的界定，它们在系统发育分析中被恢复为姐妹种，并通过一个单一的异塑性特征——第二腹节背板上的刻点——联合起来。使用现有检索表鉴定这些物种可能存在问题，因为形态特征存在重叠或模糊。例如，适用于两性最易观察的特征——前胸背板脊的发育程度——被描述为在P. ater中较弱或仅限于中部，而在P. ghilianii中则在整个背侧前胸背板表面更加强烈地发育。然而，这种区分的主观性以及缺乏图示使得其难以可靠应用，尤其是在手头没有比较材料时。
第二个特征，第一腹节背板后半部的粗刻点（P. ater）相对于光滑或具细刻点（P. ghilianii），也缺乏诊断清晰度，因为两种状况都被描述为“通常”存在，且未提及潜在的重叠。此外，体色变异增加了混淆。虽然P. ghilianii通常显示黄褐色体壁带有黑色斑纹，但黑化型与P. ater非常相似，后者通常体色均匀深暗，斑纹极少。同域发生的可能性增加了另一层复杂性。分布记录表明这些物种之间存在重叠，并且在某些地点，两个物种的标本在颜色和推定的诊断特征方面形态相似。因此，P. ater和P. ghilianii之间的物种界限仍然不清楚。
迄今为止，很少有研究在独居胡蜂中探索此类框架。蜾蠃亚科的分类工作仍然依赖于离散的形态特征，使得物种假说未经充分检验。有必要重新评估当前的形态学标准，并纳入额外数据（例如分子标记、生态偏好），以改进物种界定。遵循整合分类学的原则，本研究应用多证据方法来调查P. ater和P. ghilianii的有效性和界限。
材料与方法
取样
使用了来自多个地点的标本，以覆盖P. ater和P. ghilianii的地理分布。干制标本和乙醇保存标本（90%）均用于分子分析。形态学研究仅使用干制标本。用于系统发育分析时，使用Pachymenes sericeus (de Saussure)作为外群。
标本鉴定到种级遵循Grandinete等人提供的检索表，并与同一作者先前鉴定的材料进行了比较。标本来源于拉夫拉斯联邦大学昆虫学收藏（CEUFLA），并从以下机构借阅：美国自然历史博物馆（AMNH）、圣保罗州立大学圣若泽杜里奥普雷图校区膜翅目收藏（DZSJRP-Hymenoptera）、圣保罗大学里贝朗普雷图校区J.M.F. Camargo教授昆虫学收藏（RPSP）、南圣克鲁斯大学昆虫学收藏（CESC/UNISC）。
DNA提取、扩增、Sanger测序和序列编辑
从头部和前足移除后，从干制标本和乙醇保存标本中提取胸部肌肉。随后将标本重新装订，保存外骨骼。使用QIAquick?凝胶提取试剂盒（QIAGEN，德国）从分离的胸部肌肉中提取DNA。测试了两个线粒体蛋白编码基因的扩增效率：细胞色素c氧化酶亚基I（COI），引物：CI-J-1718和CI-N-2191；以及细胞色素c氧化酶亚基II（COII），引物：E2和COII1-2。成功扩增COI的标本Genbank登录号为PX649439至PX649454，COII为PX685873至PX685884。特异性PCR条件遵循先前研究。PCR产物使用QIAquick? PCR纯化试剂盒（QIAGEN）按照标准方案纯化，并送往圣保罗州立大学“Júlio de Mesquita Filho”大学生物资源和基因组生物学中心（CREBIO）进行测序。
使用Geneious v7.1.3评估序列质量。在同一软件中将正向和反向读数组装成重叠群。编辑重叠群以去除测序噪音并识别模糊碱基。所有样本均经过处理，但仅有17个样本至少成功扩增了一个标记。
使用MUSCLE（多序列比对）以默认参数对每个基因座进行独立比对。在Mesquite v3.31中可视化和编辑比对，该软件也用于生成串联数据集。
使用PartitionFinder2进行分区和分子进化模型选择，应用贝叶斯信息准则（BIC）。每个基因的分子进化模型列于附表。系统发育分析分别对每个基因座以及串联数据集进行。
系统发育分析
使用最大简约法（MP）、最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）进行系统发育重建。MP分析使用等权重字符。在TNT v1.1中使用“New Technology Search”进行启发式搜索，设置如下：默认模式下的Sectorial Search，200次迭代、扰动阶段设置为8（用于上加权和下加权）的Ratchet，20个周期的Drift，以及10轮的Tree Fusing。重复该过程直到最短树长至少恢复100次。随机种子设置为0。空位作为缺失数据处理。通过传统搜索下的1000次自举法评估支系支持度。
使用Garli 2.01在默认设置下推断ML树。通过1000次自举法评估分支支持度，并在PAUP* v4中总结为50%多数规则共识树。BI分析在MrBayes v3.2.3中进行，使用两个独立运行，每个运行四个链，运行5000万代，每1000代采样一次，燃烧率为20%。使用Tracer v1.6评估燃烧率、收敛性和平稳性。MP分析得到的树在WinClada v1.00.08中可视化和编辑，而ML和BI树在FigTree v1.4.0中处理。
形态特征重新评估
形态特征重新评估基于系统发育结果和对研究标本的直接比较分析。在同一地点和/或对应于同一分子支系的标本之间，以及不同支系的标本之间进行比较分析。此外，重新评估了文献中先前提出的Pachymenes属及两个研究物种的诊断特征，以评估其变异和分类学可靠性。
特别关注了传统上用于检索表和物种诊断的特征，包括与腹部和附肢颜色、体表刻点和 sculpture、雄性生殖器、唇基和头部形态、中胸配置以及翅脉相关的特征。结合分子结果解释形态变异，特别是评估观察到的变异是种内多态性还是表明种间分化。
出于诊断目的，强调具有最小个体发育变异和低环境可塑性的特征。只要可能，优先使用具有高种间稳定性的离散、定性特征，尽量减少对连续或高度可变特征的依赖。
一般外部形态和雄性生殖器的术语遵循蜾蠃亚科的传统著作。中胸侧片区域的一些术语经过调整。缩写F1–F11用于触角鞭节，而T1–T7和S1–S7分别指腹节背板和腹板。
根据在单独和合并分析中恢复的系统发育支系以及物种界定测试的结果，重新分析形态特征。对于每个支系，验证了可能支持物种识别的诊断特征的一致性。
环境空间、PCA和生态位重叠
使用两个物种的出现记录。从月度TerraClimate数据集中，包括最低温度、最高温度和降水，使用dismo包中的biovars函数推导出19个标准生物气候变量（BIO01–BIO19）。为减少多重共线性，应用Pearson相关分析并排除|r| ≥ 0.70的变量。剩余的预测因子为BIO01（年平均温度）、BIO02（平均日较差）、BIO03（等温性）、BIO12（年降水量）和BIO15（降水季节性）。这五个变量的子集共同捕捉了热平均值、日内和季节性温度变化以及水文状况，同时最小化了预测因子之间的冗余。
每个物种的可及区域（M）定义为包含所有出现点的最小凸多边形（MCP）并缓冲100公里。在每个物种特定的M（M1, M2）内及其并集（M1∪ M2）内随机采样背景点。并集区域用于校准环境空间，而个体M代表物种特定的环境可用性。使用基于M1∪ M2背景的主成分分析（PCA）总结环境空间，并将出现点和背景点投影到前两个主成分（PC1–PC2）上。
在PCA环境框架中，计算核密度网格，得到归一化的环境利用表面。使用Schoener's D量化生态位重叠，并根据Engler的框架对重叠水平进行分类：0–0.2（无重叠）、0.2–0.4（低）、0.4–0.6（中等）、0.6–0.8（高）和0.8–1.0（非常高）。使用组合背景内的排列检验生态位等价性（H0：在PCA环境中生态位无法区分），并在两个方向评估方向相似性（A → B 和 B → A）。对于每个检验，目标物种的生态位保持固定，源物种的出现点在M_B内随机化，进行1000次排列。
最后，为评估结果的稳健性，仅使用BIO01和BIO12（年平均温度和年降水量）重复整个工作流程。然后比较两次分析的Schoener's D、检验p值以及PC1 + PC2解释的累积方差。
结果
分子数据
获得了16个样本的序列（COI；472 bp）和12个样本的序列（COII；617 bp）。将它们独立比对，然后串联成包含17个终端和1089个字符的最终矩阵。在1089个字符中，841个是恒定的，185个是简约信息性的，63个是可变但非信息性的。
系统发育分析
三种系统发育方法（MP、ML和BI），无论是串联（COI + COII）还是单基因座数据集，都一致地将P. ater和P. ghilianii恢复为相互单系，并具有强大的统计支持。最大简约法产生了五个同等简约的树，尽管内部分辨率有限，但划分了两个得到良好支持的物种特异性支系，并揭示了P. ater内的两个亚组。最大似然法同样在所有数据集中支持单系性，尽管恢复了不同的内部拓扑结构，并一致地识别出P. ater内一个高度分化的谱系（PAAT01, PAAT02, PAAT04, PAAT05）。最后，贝叶斯推断也在所有分析中强烈支持两个物种的单系性，P. ater的内部关系与MP和ML基本一致，但P. ghilianii的内部关系变化较大。总之，这些结果有力地证实了物种水平的独特性，同时揭示了P. ater内相当大的遗传结构。
形态特征的重新评估
两个物种的雄性可以通过唇基形状和生殖器可靠地区分。雄性唇基提供了最易获得的诊断特征：在P. ater中，其顶端部分更宽，向前扩展且明显凸起，顶端边缘圆形；在P. ghilianii中，其更窄，正面观几乎平坦，顶端更尖。相比之下，雌性——尤其是那些具有非典型颜色的雌性——仅基于外部形态更难识别。
前胸背板脊仍然是区分P. ater和P. ghilianii的最一致的外部特征，在P. ater中发育较弱且常限于中部区域，而在P. ghilianii中则强烈发育并横跨整个前胸背板连续。本研究包含的详细照片提供了对该诊断特征的改进可视化。
雄性生殖器也显示出信息丰富的物种水平差异。生殖基节的顶端突起清楚地将物种分开，P. ater显示二到五个指状突起，而P. ghilianii仅有一个。这一特征，以及指状突刚毛的模式——P. ater中长而多数的刚毛相对于P. ghilianii中短而集中的刚毛——提供了强大的诊断潜力。
第一腹节背板（T1）上的刻点，虽然先前被提议作为诊断特征，但被证明不可靠。两个物种在刻点密度和深度上显示重叠的变异，并且没有P. ater的标本表现出早期著作中描述的真正粗刻点。这种变异似乎与一般体壁 sculpture 和颜色相关，因为黑化标本往往显示表面特征对比度降低，偶尔掩盖脊或沟。
总体而言，我们的形态比较表明，唇基形状和雄性生殖器提供了稳定的诊断特征，而前胸背板脊和T1刻点则更易变且容易误解。本文提供的图有助于准确识别P. ater和P. ghilianii，并完善了Pachymenes物种的诊断框架。
Pachymenes ater和P. ghilianii的生态位重叠
P. ghilianii的分布比P. ater更广。标本记录来自巴西南部中部、阿根廷和巴拉圭，向北延伸至圭亚那、特立尼达和多巴哥、厄瓜多尔、哥伦比亚、哥斯达黎加、巴拿马和苏里南。在巴西，该物种出现在多个生物群落，包括亚马逊、大西洋森林、塞拉多和潘塔纳尔地区。没有来自大陆沿海地区的记录。相比之下，P. ater显示出更受限的潜在分布，采集记录集中在南美洲东南部地区——特别是阿根廷、巴拉圭和巴西。
使用五个变量（BIO01, BIO02, BIO03, BIO12, BIO15）时，物种间的生态位重叠为中等，Schoener's D = 0.382。等价性检验未拒绝生态位不可区分（p = 0.525），并且两个方向的方向相似性均不显著（A → B p = 0.374；B → A p = 0.384）。PCA解释了PC1加PC2方差的70.2%（PC1 = 44.3%；PC2 = 25.9%）。在仅使用BIO01和BIO12的敏感性分析中，该指标降至D = 0.144，检验得出相同结论（等价性p = 0.602；方向相似性不显著）。
P. ater和P. ghilianii的地理分布存在部分重叠。然而，在同域种群中，每个物种的个体表现出不同的体色。P. ater的标本通常为深棕色至黑色，没有或很少有淡黄色斑纹。相比之下，鉴定为P. ghilianii的个体通常具有褐色的体壁和广泛的黄色斑纹，这是该物种大多数检查标本中观察到的模式。然而，鉴于P. ghilianii的广泛分布，观察到显著的种内颜色变异，范围从典型的带黄色斑纹的褐色模式到完全黑化的个体。
P. ghilianii的黑化个体——体壁主要为深色——记录自巴西北部（亚马逊州）、厄瓜多尔、哥斯达黎加和秘鲁。相比之下，具有更典型褐黄色颜色的个体似乎具有更广的潜在分布。一例具有黄色体壁和少量褐色斑纹的雄性标本记录自特立尼达和多巴哥。然而，该标本缺乏褐色斑纹可能是由于其年龄和保存状态（1963年采集）。观察到一例P. ghilianii标本具有完全黑色的体壁，源自哥斯达黎加。没有检查到其他具有完全深色体壁的标本；所有剩余个体至少显示一些褐色或黄色斑纹。
讨论
我们的主要假说——Pachymenes ater和P. ghilianii是相互单系的物种——在所有三种系统发育方法中均得到一致支持。所有分析都恢复了两个得到良好支持的单系群，分别对应于每个物种，无论是使用合并的还是单独的COI和COII数据集。在P. ater内，恢复了两个支系，但未观察到地理结构。相比之下，P. ghilianii的内部关系稳定性较差且缺乏高支持度，尽管进行了广泛的地理取样。
P. ater内的分化是显著的，因为其分布更受限且外部形态均匀。然而，先前的研究已经记录了该物种雄性生殖器的显著变异，支持了我们的发现。这表明尽管外部特征形态一致，但生殖器和分子分化可能发生。环境和生物地理因素可能解释这种模式。作为一个大西洋森林物种，P. ater可能由于更新世气候波动期间的栖息地碎片化而经历遗传隔离。一项更全面的系统地理学分析，包括有针对性的取样和形态测量数据，将有助于检验这一假说。
尽管关于单独使用COI条形码进行物种界定的争论仍在继续，但当与其他证据线索整合时，它仍然是一个有用的工具。我们的结果与其他整合分类学方法一致，特别是在基于单系性和谱系的物种概念下，这些概念将相互单系性视为物种识别的强有力标准。
因此，分子证据证实了先前分类学修订中提出的P. ater和P. ghilianii之间的形态学区分。所使用的线粒体标记在区分这些物种方面是有效的。虽然我们强调整合形态学的重要性，但我们也提倡在蜾蠃亚科的分类学研究中使用线粒体标记。
尽管线粒体基因树可能不反映物种历史，但基于线粒体基因组规模数据的近期分析已经恢复了马蜂亚科内完善确立的拓扑结构，加强了线粒体标记对于理解历史关系的效用。我们的结果进一步证明了这些标记对于独居蜂物种界定的有用性。从较老的博物馆标本中提取DNA，尽管由于干制昆虫的降解而具有挑战性，但产生了高质量的COI和COII序列。
结论
我们的研究结果为Pachymenes ater和P. ghilianii的相互单系性提供了强有力的分子支持，在整合分类学框架下确认了它们作为 distinct species 的地位。此外，尽管P. ater外部形态一致，但在其内部检测到分化谱系，凸显了结合分子和形态学数据以揭示隐存多样性的重要性。总之，我们的结果加强了整合方法在澄清形态保守昆虫类群物种界限方面的价值。
