《Animals》：An Annotated Checklist of Symbiotic Copepods of Mollusks in the Global Oceans: A Review of Diversity, Hosts and Geographical Distributions
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本综述通过整合转录组（RNA-seq）和靶向代谢组（GC-MS）分析，系统阐述了高（H组）与低（L组）出生体重新生仔猪回肠发育的分子差异。研究发现，H组仔猪回肠中与DNA复制（RFC3、PCNA、MCM3、MCM10）、细胞分裂（AURKA、AURKB）及细胞周期调控（CCNB2、CCNA2、CCNF）相关的基因表达显著上调，同时丙酮酸（pyruvic acid）浓度升高，提示其细胞增殖与能量代谢更为活跃。此外，蔗糖酶-异麦芽糖酶（SI）基因的上调表明H组仔猪碳水化合物消化吸收能力更强。这些分子特征为解析出生体重影响仔猪肠道发育、生理适应性及生长潜能的机制提供了新见解，并为改善低出生体重仔猪生长性能提供了潜在靶点。
引言
现代养猪业中，通过持续遗传选择提高了母猪的产仔数，但这也导致了新生仔猪平均体重下降和均匀度降低。较大的产仔数常常导致子宫空间受限和胎盘功能受损，从而增加了宫内生长受限（IUGR）仔猪的发生率。IUGR仔猪表现为低出生体重和器官发育不成熟，导致活力下降、初乳摄入量减少、免疫力减弱，进而死亡率升高。特别是，低出生体重仔猪与肠道形态受损密切相关，如绒毛高度降低和凋亡信号增加，这削弱了肠道屏障功能。此外，其胃肠道发育不全损害了营养吸收效率，导致生长迟滞和断奶前后死亡率升高，给养猪生产者造成重大经济损失。因此，新生儿体重和肠道成熟度是决定其生存和整体生长性能的关键因素。建立肠道发育受损的分子和代谢机制基线至关重要，这为未来设计针对弱势新生儿的有效干预策略提供了必要的科学基础。肠道在出生后的结构和功能准备状态与营养摄取和免疫能力密切相关，较小的仔猪通常表现出生理进程延迟，在性能方面处于劣势。然而，早期体重影响肠道功能的分子通路和代谢过程仍知之甚少。近年来，组学技术已成为通过整合多维数据集（包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学）来阐明复杂生物过程的强大工具。因此，本研究旨在利用转录组和代谢组分析相结合的方法，阐明不同出生体重仔猪肠道发育的分子机制，重点关注这些差异如何影响生存。研究结果有望为提高生长受限新生儿的生存率并最终改善养猪生产系统提供科学基础。
材料与方法
本研究在汉阳国立大学的研究设施中进行，并获得了汉阳国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准号：2024-1）。
动物与处理
从同一商业猪场的12头经产母猪（约克夏×长白×杜洛克杂交）获得了126头平均出生体重为1.17 ± 0.02 kg的新生仔猪，产仔数范围为9至12头。所有母猪均使用同一人工授精公司提供的精液进行授精。在出生后立即测量体重，并根据出生体重百分位数将仔猪分为两组：高出生体重组（H组；前5%，n = 6）和低出生体重组（L组；后5%，n = 6），以确保组间出生体重有明显区别。每组内，以相等比例选择雄性和雌性仔猪，以尽量减少潜在的性别相关效应。新生仔猪、窝次以及用于采样的仔猪特征见补充表S1。
样品采集
在测量体重后立即进行新生仔猪回肠的采样。所有动物程序均按照IACUC批准的指南进行。根据批准的机构方案对仔猪实施人道安乐死，然后通过解剖收集组织。在距盲肠连接处5厘米处切取回肠段以获得小肠样品。随后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗样品，并立即在液氮中速冻，储存于-80°C直至分析。
RNA提取与RNA测序
从每组（H和L）中选择五个回肠样品进行转录组分析。使用1 mL TRIzol?试剂从约100 mg回肠组织中提取总RNA。提取过程使用SHG-15D匀浆器研磨冷冻的回肠样品完成。使用Nanodrop F-3100定量总RNA浓度，并使用Agilent 4200 TapeStation评估RNA质量和完整性。仅使用RNA完整性数值（RIN）≥ 7.0的样品进行后续文库构建。之后，使用Poly(A) RNA Selection Kit分离mRNA，并使用CORALL RNA-Seq V2 Library Prep Kit从cDNA构建文库。采用基于Poly(A)的mRNA富集和双末端测序以提高转录本检测效率，包括中低丰度转录本。在NovaSeq 6000上进行测序，读长为100 bp，每个样品产生约4 Gb的双末端测序数据，这通常被认为足以进行全面的mRNA-seq分析，包括低丰度转录本的检测。为了质量控制，使用FASTP 1.0默认参数处理原始测序读数，包括接头去除、低质量读数过滤以及自动应用最小读长和碱基质量阈值。修剪后，仅保留高质量读数并使用STAR 2.7.11b与参考基因组比对，生成的比对读数用于下游分析。使用Salmon 1.10.x工具计算基因表达水平。使用每百万计数（CPM）进行数据标准化以调整文库大小的差异，然后进行M值的修剪均值（TMM）标准化以校正表达组成偏差并提高结果的可靠性。
RNA-Seq数据分析
使用ExDEGA（v5.2.1；ebiogen，韩国首尔）进行RNA-Seq数据分析，这是一个基于Microsoft Excel的差异基因表达分析软件。基于猪（Sus scrofa）参考基因组，对总共27,376个注释基因进行差异表达分析。根据以下标准选择差异表达基因（DEGs）：折叠变化≥ 1.5且标准化log2表达值≥ 4。组间基因表达水平的差异在调整后p值（FDR）< 0.05时被认为具有统计学意义。使用DAVID数据库对识别出的DEGs进行功能注释。基因本体（GO）分析包括将DEGs分类为生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别，以及基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）的通路分析。使用KEGG Mapper工具进行KEGG通路映射。对于DAVID和KEGG分析，选择猪（Sus scrofa）作为基因符号注释的参考物种。使用ExDEGA软件内的集成可视化工具GraphicPlus进行数据可视化。使用Multi Experiment Viewer（MeV）4.9.0软件可视化DEG模式。
基因选择与实时定量PCR
通过DEGs的功能注释分析选择基因。H组中上调的基因参与DNA复制、细胞分裂、有丝分裂细胞周期相变、碳水化合物结合和营养代谢。H组中下调的基因与胶原三聚体和丝氨酸型内肽酶复合物相关。
为了验证mRNA-seq数据，进行了实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。使用与RNA-seq分析相同的仔猪回肠样品进行RT-qPCR分析，每组（H和L）五个生物学重复。每个样品进行三次技术重复以确保技术可重复性。使用TRIzol?试剂从约100 mg回肠组织中提取总RNA，并使用gDNA eraser premix去除基因组DNA污染。然后使用PrimeScript? FAST RT Reagent Kit按照制造商的说明将纯化的RNA逆转录成cDNA。使用TB Green? Premix Ex Taq? II FAST qPCR和qTOWER3G实时PCR系统进行RT-qPCR，遵循制造商方案。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因用于相对基因表达水平的标准化。用于靶基因验证的引物序列列于补充表S2。使用2?ΔΔCt方法计算相对基因表达水平，归一化至GAPDH表达，随后转换为log2折叠变化值。
GC-MS分析
代谢物的GC-MS分析根据[21]进行。将回肠组织（20 ± 0.05 mg）在700 μL提取溶剂（乙腈：三重蒸馏水，7:3，v/v）中使用SHG-15D匀浆器匀浆。匀浆后离心，收集上清液并使用HyperVAC-LITE干燥。对于衍生化，加入50 μL MTBSTFA + 1% TBDMCS，而BSTFA专门用于异柠檬酸。使用标准品（包括丙酮酸、琥珀酸、富马酸、γ-氨基丁酸（GABA）、苹果酸、乙醛酸、顺乌头酸、L-谷氨酰胺、柠檬酸、α-酮戊二酸、L-谷氨酸和异柠檬酸）构建浓度为0.5、2.0、5.0、10、25和50 μM的标准曲线，R2值大于0.99。在QP2020NX系统上进行GC-MS分析，该系统配备HP-5ms毛细管柱。以分流模式（1:25）注入1 μL样品。炉温程序如下：初始温度50°C保持2分钟，以20°C/分钟升至150°C，然后以8°C/分钟升至300°C。使用高纯度氦气作为载气，恒定流速1 mL/分钟。离子源和接口温度设定为280°C，在m/z范围30–650内以SIM模式采集数据。对于GC-MS数据，使用概率商归一化（PQN）进行归一化，以H组作为参考，然后进行log2转换和Pareto缩放，使用MetaboAnalyst 6.0生成热图和主成分分析（PCA）图，从而评估组间分布和方差。
转录组与代谢组相关性分析
基于转录组分析，总共选择了11个与DNA复制、细胞分裂和有丝分裂细胞周期相变相关的DEGs进行相关性分析。靶向代谢组分析使用了12种代表能量代谢的选定代谢物。为了评估基因表达水平与代谢物浓度之间的关联，使用个体水平数据（n = 10）进行了Spearman等级相关性分析。鉴于样本量有限，采用了非参数方法。最初使用p < 0.05的阈值评估个体相关性的统计学显著性。为了考虑多重检验，应用了错误发现率（FDR）校正，并且p值（FDR）< 0.05的相关性被认为额外显著。使用预定义阈值解释相关性强度，|ρ| ≥ 0.50分类为中等相关性，|ρ| ≥ 0.80分类为强相关性。将结果可视化为热图，基因根据其功能类别排序，以探索基因功能组与代谢物之间的整体关联模式。所有相关性分析均使用RStudio软件版本2025.09.2进行。
统计分析
为了评估所选新生仔猪体重和RT-qPCR结果差异的显著性，使用SAS软件版本9.4进行统计分析。由于每组每窝只选择一头仔猪，研究设计最小化了潜在的窝效应。因此，统计模型中未将窝作为随机效应。在统计分析之前，使用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性，并使用Levene检验评估方差齐性，未发现违反这些假设的情况。应用独立双样本t检验比较两组（H和L）之间的体重、RT-qPCR结果和GC-MS数据。p < 0.05被认为具有统计学显著性，而0.05 ≤ p < 0.10被视为趋势。对于转录组分析，使用适当的统计模型识别DEGs，并使用Benjamini–Hochberg FDR对p值进行多重检验调整。调整后p值（FDR）< 0.05的基因被认为具有统计学显著性。
结果
H组与L组之间的差异表达基因
通过RNA-seq分析总共检测到27,376个转录本。基于折叠变化≥ 1.5、标准化表达（log2）≥ 4且调整后p值（FDR）< 0.05的标准，在H组和L组之间识别出112个DEGs，列于补充表S3。其中89个DEGs在H组中上调，23个在H组中下调（p < 0.05）。散点图显示了H组和L组之间上调和下调DEGs的分布。基于DEG表达谱的主成分分析（PCA）显示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别解释了74%和12%的方差，清楚地区分了H组和L组。此外，回肠基因表达模式的层次聚类热图揭示了两组之间明显的转录差异。
DEGs的功能注释分析
使用DAVID对H组和L组之间的DEGs进行功能注释，重点关注基于p值在生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）和KEGG通路类别中排名前10的富集术语。排名前10的BP术语包括：细胞分裂、有丝分裂纺锤体组织、有丝分裂细胞周期、染色体分离、有丝分裂胞质分裂、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性调节、有丝分裂染色体浓缩、DNA复制、有丝分裂细胞周期相变和减数分裂染色体分离。与每个GO术语相关的上调和下调基因列于补充表S4。
对于CC术语，排名前10的富集类别为：细胞核、染色体、着丝粒区域、动粒、中间体、染色体乘客复合体、核质、外动粒、纺锤体极、中心体和微管。与每个CC术语相关的DEGs列于补充表S5。
排名前10的MF术语包括：微管结合、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性、ATP结合、微管马达活性、蛋白激酶结合、后期促进复合物结合、蛋白丝氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ATP水解活性和碳水化合物结合。相关的上调和下调基因列于补充表S6。
排名前10的富集KEGG通路为：细胞周期、孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、DNA复制、马达蛋白、碱基切除修复、人类T细胞白血病病毒1感染、核苷酸切除修复、细胞衰老以及补体和凝血级联。与每个KEGG通路相关的DEGs列于补充表S7。
选定基因表达的实时定量PCR验证
选定基因的RT-qPCR分析结果如图所示。使用每组（H和L）五个生物学重复的回肠样品进行RT-qPCR验证。使用2?ΔΔCt方法计算相对基因表达水平，并归一化至GAPDH表达。RFC3、PCNA、MCM3、MCM10、AURKA、AURKB、CCNB2和SI基因在H组中相对于L组相对上调（p < 0.05）。此外，CCNA2和CCNF基因在H组中显示出上调趋势（0.05 ≤ p < 0.10）。相反，MMP1、PLAU和COL18A1基因在H组中下调（p < 0.05）。
能量代谢的靶向代谢组学
结果如图所示。PCA和热图分别如图所示。PCA解释了总方差的68.3%，其中PC1占45.8%，PC2占22.5%。在95%置信区间内评估时，未观察到组间有明显分离。相反，热图显示单个代谢物的模式在H组和L组之间是可区分的。丙酮酸在H组中的浓度显著高于L组（p < 0.05）。其他代谢物，包括柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、乙醛酸、GABA、琥珀酸、富马酸和苹果酸，在H组和L组之间没有显著差异。
转录组与代谢组数据的相关性分析
Spearman等级相关性分析的结果以热图形式呈现。PCNA、MCM3、AURKA、AURKB、CCNA2、CCNB1、CCNB2和CCNF与丙酮酸呈强正相关（ρ > 0.80, p < 0.05）。特别是，AURKA、CCNA2和CCNB2与丙酮酸的相关性即使在FDR校正后仍保持显著强相关（ρ > 0.80, p < 0.05, q < 0.05）。此外，RFC3、MCM10和SI也与丙酮酸呈中度至强正相关（ρ > 0.50, p < 0.05）。相反，RFC3、PCNA和MCM10与柠檬酸呈中度至强负相关（-0.80 ≤ ρ < -0.50）。所有基因-代谢物对的详细相关系数及相应的p值和q值提供在补充表S8中。
讨论
DNA复制
新生仔猪的小肠通过持续的上皮细胞更新经历快速发育，这对于肠道功能和再生至关重要。因此，在早期细胞周期阶段精确调控DNA复制对于维持新生儿肠道成熟期间的上皮更新至关重要。特别是，早期细胞周期阶段准确的DNA复制与随后的细胞分裂和肠道发育密切相关。在本研究中，识别出参与DNA复制通路的DEGs。RFC3和PCNA表达增加与DNA复制复合物的形成和复制过程的效率有关。在猪和鸡中，小肠中的PCNA表达已被广泛用作DNA复制和细胞增殖的指标，并与肠上皮再生相关。在猪中，PCNA表达在哺乳期增加，但会因断奶应激而暂时受到抑制。此外，猪中MCM3和MCM10表达增加与基因组稳定性的维持和肠上皮细胞增殖相关，而这些基因表达减少则与细胞周期异常和细胞增殖受损有关。综上所述，在高出生体重新生仔猪回肠中观察到的DNA复制相关基因上调可能反映了与肠上皮增殖和成熟相关的分子特征。
细胞分裂与有丝分裂细胞周期相变
参与细胞分裂的基因AURKA和AURKB在H组中上调。AURKA和AURKB在有丝分裂和染色体分离过程中作为关键调节因子发挥作用。在猪中，AURKA和AURKB的缺陷据报道会通过破坏纺锤体形成、微管组装和染色体排列来损害胚胎发育。此外，在H组中同样上调的CCNB2、CCNF和CCNA2据报道与肠上皮细胞增殖以及细胞分裂时机和保真度的调节有关。综上所述，在H组中观察到的极光激酶和细胞周期相关细胞周期蛋白基因的上调可能反映了高出生体重仔猪回肠上皮中有丝分裂进程相关的转录特征。结合前面描述的DNA复制相关基因的上调，这些发现提示了连接DNA合成与随后细胞分裂的协调转录变化。这种协调与出生后肠道发育期间的上皮更新密切相关，并且可能与观察到的出生体重组间肠道成熟差异相关。
营养消化与吸收
SI作为一种对碳水化合物消化和能量供应至关重要的消化酶，其缺乏与能量吸收减少和胃肠道功能障碍相关。在猪中，SI在小肠中水解膳食蔗糖方面起着核心作用，并直接参与碳水化合物的消化和吸收。Ayuso等人报道，低出生体重新生仔猪表现出肠道发育延迟，并伴有SI表达降低，这与出生后生长受损相关。类似地，Villagómez-Estrada等人观察到低出生体重仔猪的SI表达较低，与本研究结果一致。从功能角度来看，较高的SI表达可能反映了肠道碳水化合物消化和吸收能力相关的转录特征。这种表达模式可能与出生体重组间早期出生后发育期间肠道代谢活性的差异相关。
能量代谢
回肠的代谢组学分析显示，H组中丙酮酸的浓度显著更高。作为糖酵解的终产物，丙酮酸是与细胞能量代谢相关的关键代谢中间体。结合在H组中观察到的与DNA复制、有丝分裂进程和碳水化合物代谢相关的基因上调，丙酮酸水平升高可能反映了出生后早期肠道能量代谢特征的差异。这些发现与先前报道较重仔猪比较轻仔猪丙酮酸水平更高的报告一致，支持了出生体重与早期能量代谢之间的关联。
在H组和L组之间，大多数其他代谢物未观察到显著差异，这可能反映了新生仔猪在出生后立即进行的能量平衡和代谢稳态的生理调节。此外，有限的样本量可能降低了检测其他代谢物细微差异的统计功效。
细胞周期相关转录与能量代谢之间的关联
在转录组-代谢组相关性分析中，丙酮酸与细胞周期相关基因的表达呈正相关，而RFC3、PCNA和MCM10与柠檬酸呈负相关。这些发现表明，细胞周期相关的转录特征可能与糖酵解而非三羧酸循环相关的代谢特征共同观察到。此外，SI与丙酮酸呈正相关。然而，这些结果基于有限样本量的相关性分析，因此在因果推断和功能解释方面存在局限性。
结论
在本研究中，通过整合转录组和靶向代谢组分析，探索了不同出生体重新生仔猪回肠的分子差异。结果表明，高出生体重（H）组仔猪表现出相对较高的与细胞分裂、DNA复制和能量代谢相关的基因表达，提示存在与肠道发育相关的转录特征差异。此外，靶向代谢组分析显示H组中丙酮酸浓度显著更高，这可能反映了与糖酵解过程相关的能量代谢特征差异。
综上所述，这些转录组和代谢组学发现表明，高出生体重仔猪可以被表征为一个在出生后早期观察到与肠上皮增殖和能量代谢相关分子特征的群体。本研究生成的数据集可作为探索与新生儿肠道发育相关的候选基因和代谢通路的基础资源。然而，由于目前的发现是基于有限样本量的观察性分析，需要纳入更大队列以及功能或组织学验证的进一步研究来阐明这些分子特征的生理相关性，并建立出生体重与肠道发育之间的因果关系。
