《TRENDS IN Cell Biology》：Endolysosomal transport at the crossroads of cellular signaling
编辑推荐：
本综述聚焦于内溶酶体系统的膜运输与细胞信号传导的交叉调控。文章以酵母为模型，系统梳理了细胞器膜身份标记物（如Rab GTPases和磷酸肌醇）如何通过调控膜融合与裂变的核心蛋白机器（如GEFs/GAPs和HOPS/CORVET拴系复合物），从而整合营养信号（如TORC1通路），影响自噬、降解与循环等关键生命过程。内容前沿，结构清晰，适合细胞生物学研究者深入阅读。
内溶酶体系统概述
真核细胞通过内溶酶体系统调控营养摄取、维持质膜组成，并参与细胞质量控制和氨基酸循环。该网络由多种细胞器构成，物质通过囊泡或管状载体在它们之间运输。膜接触位点（MCSs）也直接介导脂质等物质的交换。质膜上待降解的膜蛋白通过内吞作用进入早期内体（EEs）。根据细胞状态，营养转运蛋白或受体可从早期内体通过循环内体（REs）返回质膜，或被泛素化标记，由内体分选复合物（ESCRT） machinery 分选进入腔内囊泡（ILVs），最终在晚期内体（LEs）成熟后与溶酶体（酵母中为液泡）融合完成降解。内体成熟过程涉及形态、pH值和膜身份标记物的动态变化，其精确调控机制是当前研究的焦点。
2。(B) Rab亚家族的小GTP酶是细胞器膜的身份标记。它们是开关样蛋白，在非活性（GDP）和活性（GTP）状态之间循环。当处于非活性状态时，这些脂化蛋白可被伴侣蛋白GDI结合以保持其可溶性，便于在膜间穿梭。它们通过GEF促进的核苷酸交换被激活。为了失活，Rabs需要GAP来完善GTP酶的活性位点。'>
膜身份标记物
为了协调内溶酶体系统中的所有膜运输过程，细胞器表面携带特定的身份标记物。两个相互依赖的系统提供膜身份的特异性：小GTP酶中的Rab亚家族蛋白，以及脂质标记，特别是其肌醇头基磷酸化状态不同的磷脂酰肌醇磷酸盐（PIPs）。这两种标记通常共同作为协同检测器，招募特定的蛋白机器，从而在这些细胞器上实现膜融合或重塑。
Rab GTPases是标志性蛋白
Rab GTPases是囊泡运输的关键组织者。它们通过翻译后修饰连接到C末端半胱氨酸残基的异戊二烯锚定与膜结合。在胞质溶胶中，该膜锚被GDP解离抑制因子（GDI）相互作用所屏蔽。Rab GTPases在细胞中随机采样膜，并由GDI递送和提取。在特定的细胞器上，当Rabs遇到其对应的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）时，结合的GDP被更丰富的GTP交换。这降低了对GDI的亲和力，阻止了进一步的膜提取，并通过GTP的γ-磷酸稳定效应环，将Rab从非活性状态切换到活性状态。活性的Rabs与效应蛋白相互作用，这些效应蛋白具有Rab特异性并将特定的生物学功能赋予膜。效应蛋白的例子包括用于囊泡运输的马达蛋白、产生细胞器特异性PIPs的脂质激酶，以及对囊泡与靶细胞器初始结合重要的拴系因子。为了循环利用，Rabs被GTP酶激活蛋白（GAPs）失活，GAPs完善活性位点并允许GTP水解为GDP。只有在这种非活性的GDP结合状态下，Rabs才能被GDI提取到胞质溶胶或进行新一轮的GEF介导的激活。
携带 destined for degradation in the lysosome 的泛素化膜蛋白的早期内体膜和内吞囊泡由Rab5 GEF标记，后者在这些表面激活Rab5。相反，晚期内体携带Rab7。Rab7的保守GEF是二聚体Mon1-Ccz1复合物。后生动物细胞的REs以Rab4、Rab11和Rab14为特征。
磷脂酰肌醇磷酸盐是标志性脂质
PIPs作为膜身份标记物，招募具有PIP特异性结合域的蛋白质。早期内体膜上有磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI(3)P），而晚期内体和溶酶体则额外含有进一步磷酸化的脂质PI(3,5)P2。PI(3,5)P2是一种低丰度脂质，在溶酶体应激期间会显著上调。它结合多种溶酶体膜蛋白，包括V1/V0-ATPase和几种离子转运蛋白，从而调节其活性以调整溶酶体功能。最近的研究表明，液泡PI(3,5)P2水平对于酵母细胞分裂期间细胞器不对称性的建立至关重要。
两个脂质激酶复合物在内体和自噬体上产生PI(3)P。Rab5在早期内体上招募并激活PI-3-激酶复合物II，而Rab1在自噬体上激活PI-3-激酶复合物I。这些四聚体复合物由激酶Vps34、Vps30、Vps15和Atg14（复合物I）或Vps38（复合物II）组成。在从晚期内体向溶酶体或液泡的过渡期间，PI(3)P被PIKfyve脂质激酶复合物进一步磷酸化为PI(3,5)P2。该复合物包含一个Vac14五聚体支架、激酶PIKfyve/Fab1和具有相反功能的Fig4磷酸酶。这两个亚基不仅是脂质激酶和磷酸酶，也是蛋白激酶和磷酸酶。
内体成熟
从早期内体到晚期内体的成熟以ILVs的形成和从具有管状结构的早期内体细胞器向圆形晚期内体的转变为标志，后者也称为多泡体。ILV的形成需要ESCRT。ESCRT由四个连续作用的多亚基复合物和ESCRT-IV ATP酶 Vps4组成。前四个复合物识别并将泛素化的货物蛋白分选到膜域中，这些膜域向内体的腔内出芽。Vps4活性是ILV形成和ESCRT回收所必需的。
内体成熟还依赖于内体或溶酶体与内质网之间的膜接触位点。在哺乳动物细胞中，内体与内质网之间的膜接触位点支持内体成熟并定义内体裂变发生的位置。此外，内体成熟需要桥状转运蛋白Vps13家族的脂质转移蛋白以及多个膜接触位点的胆固醇转运蛋白。在酵母中，Any1 scramblase在内外叶之间分配脂质并有助于成熟。据认为这些膜接触位点为内体系统提供脂质以形成ILVs或在溶酶体损伤期间促进膜修复。
当内体成熟时，其腔室被V-ATPase酸化并调整其离子含量。低pH值和适当的离子组成不仅是最终溶酶体腔室中水解酶最佳活性所必需的，而且也是早期内体和晚期内体上货物受体从其结合的货物上释放所必需的。受体在分选连接蛋白、retromer复合物和相关受体的帮助下形成的管状载体中积累，并运输回高尔基体进行进一步的蛋白分选。
除了形态和pH值变化，膜在内体成熟过程中获得不同的蛋白身份。在早期内体上，Rab5招募GEF复合物Mon1-Ccz1，后者进而激活晚期内体Rab7并促进Rab5 GEF的释放。在这种转变过程中，晚期内体积累ILVs，因此被称为多泡体。在哺乳动物细胞中，Rab5似乎以两阶段过程离开成熟中的内体。第一阶段不依赖于Rab7，第二阶段需要Rab7并导致Rab5阳性膜的分离。这表明早期内体结构并非仅由新进入的内吞囊泡从头形成，而是源自成熟晚期内体的循环过程。
Rab7 GEF Mon1-Ccz1处于这一成熟过程的中心。Mon1和Ccz1各由三个长蛋白结构域组成，呈三角形排列。每个亚基的LD2和LD3朝向膜，而LD1s共同形成复合物的活性位点。Mon1-Ccz1复合物通过脂质和蛋白质相互作用结合到内体上，这决定了其在内体和自噬体上的功能和活性。两个亚基都有助于脂质结合。Mon1通过带正电荷的表面与带负电荷的脂质头基如PI(3)P相互作用，而Ccz1通过两亲性螺旋结合脂质包装缺陷。前一种机制对于Mon1-Ccz1在内体成熟中的功能很重要，而后一种机制对于其在自噬中的正常功能是必需的。在后生动物中，Mon1-Ccz1有第三个亚基Bulli/RMC1，似乎能增强膜结合或调节该复合物。该亚基可能是后生动物细胞更复杂的内膜系统的进化适应。除了脂质，Mon1-Ccz1还与内体上的Rab5-GTP结合，这既招募了复合物，又解除了通过Mon1 N端的自抑制，从而增强了GEF活性。在酵母中，这个自抑制环还被Yck3酪蛋白激酶磷酸化，从而阻断Rab5与Mon1的结合。这表明GEF活性也受到内体激酶的严格调控，将膜运输和细胞器身份变化与细胞信号传导联系起来。
在后生动物细胞中，Mon1-Ccz1复合物还通过招募Rab5-GAP TBC1D18来控制Rab5在Rab转换过程中的失活。一致地，消耗TBC1D18会减少内体形成和溶酶体中的货物蛋白降解。在酵母中，这种相互作用不太清楚。这里，Rab5特异性GAP Msb3结合溶酶体相关细胞器生物发生复合物-1，后者不需要Rab7样的Ypt7，但需要Rab5样的Vps21用于内体定位。两个系统中Rab7 GEF和Rab5 GAP活性的精确协调仍有待进一步剖析。
高尔基体上的Rab激活——不同的蛋白质，相似的原则
类似的GEF活性调控原则也见于高尔基体上Rab GTPases的组织。TRAPP II和TRAPP III GEF复合物分别激活Rab GTPases Ypt31和Ypt1。这两个多亚基复合物共享相同的核心蛋白围绕催化中心。然而，它们的辅助亚基不同。结构分析表明，带有两个大亚基Trs120和Trs130以及额外亚基Tca17和Trs65的TRAPP II，与带有辅助亚基Trs85的TRAPP III相比，其活性位点相对于膜平面的高度被抬升。活性位点相对于膜的这种不同高度反映在相应Rab GTPase的超变域长度上。连接GTP酶结构域和异戊二烯化C末端的约30个氨基酸的连接区定义了Rab GTPase所能达到的膜距离。然而，对于TRAPP复合物，不仅是长度，HVD的一级序列对于特定的Rab-GEF相互作用也很重要。两个TRAPP复合物都通过其共享的Trs31亚基与Rab1/Ypt1和Rab11/Ypt31的HVD结合。类似的GEF机制也在高尔基体上所需的Ypt6/Rab6特异性Ric1-Rgp1复合物中被揭示。在这里，Rgp1有一个特定的Ypt6/Rab6 HVD结合位点，将Rab导向Ric1亚基的催化位点。在所有三种情况下，Rab的HVD中的一个保守基序都参与GEF结合。类似的机制是否也适用于其他GEF，特别是内体系统中的Mon1-Ccz1，尚待探索。Rab7的HVD在体内定位该GTP酶到内体和溶酶体中起作用，表明它也有助于膜靶向。测量Ypt7的GTP酶结构域与膜之间的距离揭示了GTP酶结构域根据结合伴侣的不同而重新定向，这可能是由于HVD的可变特性。目前尚不清楚为什么在进化过程中保留了Rab和激活GEF之间的两个非常特异的结合位点，即GTP酶结构域和HVD，但这暗示了Rab激活中存在一个潜在的调控层面，需要在未来进一步探索。
内体和液泡的拴系与融合事件
近年来，通过解析来自酵母的多亚基拴系复合物HOPS和CORVET的结构，对内体和液泡拴系事件机制获得了重要见解。
两个复合物具有相同的结构核心，由亚基Vps11和Vps18以及由Vps16和Vps33组成的SNARE结合模块构成。此外，CORVET携带两个亚基Vps3和Vps8，而HOPS则含有Vps39和Vps41。这些亚基为每个复合物提供特异性。Vps3和Vps8与Rab5家族蛋白结合，而Vps41和Vps39与Rab7样的Ypt7相互作用。为了有效拴系，HOPS主要依赖于两个膜上的Ypt7。相比之下，CORVET除了需要Rab5，还需要PI(3)P和膜中的脂质包装缺陷。高等真核生物的HOPS复合物不结合Rab7，而是结合Rab2、Arf样GTPase Arl8以及Rab39。
两个拴系复合物的两个Rab结合位点位于相对的两端。除SM蛋白 Vps33外，所有亚基都有一个N端β-螺旋桨和一个C端α-螺旋桨结构域。核心亚基Vps11和Vps18形成一个反平行主链，与Vps16和Vps33的SNARE模块紧密结合。Rab特异性亚基通过C端部分与该核心结合并向外延伸。因此，HOPS可以桥接30纳米的距离。HOPS亚基Vps41显示出高度灵活性，而相应的CORVET亚基Vps8则牢固地附着在核心上。Vps41的α-螺旋桨长度对于HOPS在融合中的全部功能至关重要，表明Vps41在拴系中作为分子尺发挥作用，以促进融合前有效的SNARE组装。
为了拴系膜，HOPS和CORVET复合物通过结合每个位点上的特异性Rab GTPase来桥接两个膜之间的距离。这是囊泡和靶膜之间的第一个可逆接触。拴系复合物在膜之间的定位似乎是正确排列相应SNARE的SNARE结构域的关键步骤，这是通过SM蛋白亚基Vps33实现的。随后的SNARE拉链式和折叠然后促进囊泡与受体膜的完全融合。产生的顺式SNARE复合物最终被α-SNAP和AAA-ATPase NSF回收。结构上的见解表明存在一个模型，其中顺式SNARE复合物被至少一个Sec17分子结合。六聚体Sec18环然后能够侧向打开，将SNARE束插入其中心孔。Sec18的ATP水解然后解开SNARE复合物。这种裂开的六聚体环结构解释了SNARE回收是如何发生的，而无需展开SNARE的N端部分，这些部分可能仍与HOPS复合物相互作用。
虽然CORVET介导的内体融合允许内体成熟的进行，但HOPS介导的晚期内体和液泡的融合导致ILVs被递送到液泡腔室，在那里水解酶将所有大分子分解成它们的前体。
内体和溶酶体/液泡的信号传导
溶酶体或液泡不仅是发生降解的细胞器，也是离子如钙、磷酸盐和氨基酸的回收和储存场所。这些离子根据需要输出到胞质溶胶。
保守的雷帕霉素靶蛋白复合物1是一个激酶复合物，感知细胞中的氨基酸水平，并通过磷酸化几种蛋白质来促进生长。因此，高的TORC1活性抑制自噬。该复合物定位于内体和溶酶体/液泡，其定位受到酵母特异性亚基Tco89自主磷酸化的严格时空控制。一个新的内体亚群被描述，称为信号内体。这些内体携带TORC1及其调节性Ego复合物。重要的是，它们对ESCRT-IV ATP酶 Vps4呈阴性，表明它们不形成ILVs。SEs表面携带酵母Rab5-GTP酶 Vps21和酵母Rab7同源物Ypt7，它们的形成和维持依赖于液泡HOPS拴系复合物。TORC1还磷酸化Fab1脂质激酶，导致两种复合物部分重新定位到SEs。实际上，磷酸化增强了Fab1活性以产生PI(3,5)P2，Atg18作为PROPPIN家族成员，与retromer复合物结合，结合到PI(3,5)P2上。该复合物被称为CROP。作为CROP的一部分，Atg18似乎隔离了特定的氨基酸转运蛋白或钙转运蛋白等货物，这些货物从液泡上被掐断以形成或将膜分选到SEs。重要的是，SEs的形成需要PI(3,5)P2合成和TORC1活性，证明了运输和信号传导之间的联系。这进一步例证了液泡上的细胞信号传导如何直接与膜身份的变化耦合，从而使内溶酶体系统适应细胞需求。未来的工作需要了解SEs的生物发生是如何被详细调节和控制的。
作为Rab7效应器的Retromer和Rab7-GAP TBC1D5在氨基酸诱导的mTORC1信号传导中发挥作用。在缺乏retromer的细胞中，TORC1不被氨基酸刺激，导致自噬。在酵母中观察到类似的情况，缺失Ypt7特异性GAP Gyp7会减少TORC1的营养感知。Gyp7与Ypt7激活剂Mon1-Ccz1一起定位于内体结构，而不是在液泡上，这表明对内体膜上可用活性Ypt7的微调。结合最近关于CROP的发现，Rab7-GAP活性可能与TORC1向SEs表面的分选相耦合，以调节酵母和后生动物细胞中的营养信号传导，这表明膜运输与营养感知和信号传导之间存在紧密耦合。
concluding remarks
本综述总结了关于Rab GTPases在内溶酶体膜运输和身份中作用的一些最新见解。尽管我们可能已经确定了大多数Rab5和Rab7的GEFs和GAPs，但我们远未理解它们与细胞营养感知和整合信号传导的协调和相互作用。例如，Rab7 GEF Mon1-Ccz1是高度磷酸化的，可能受多种激酶如TORC1的控制。同样，我们仅对少数情况了解GAPs和GEFs的活性是如何协调的，而且常常缺少细节。此处的体内缺失突变体分析可能会产生误导，因为它们只反映特定蛋白质缺失的情况，而体外测定可能只重现没有调控回路的最小系统。未来的研究需要结合多种方法，以获得关于Rab在内体和溶酶体功能及其与细胞内信号传导交叉联系的更完整图像。关于从液泡/溶酶体出芽的膜的令人兴奋的最新见解表明，我们远未理解内溶酶体系统的复杂性及其与信号传导过程的耦合。
