《Plant Communications》：Comparative transcriptomic and co-expression analyses enable the discovery of key enzymes responsible for oleuropein biosynthesis in olive (Olea europaea)
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本研究针对油橄榄中重要风味物质橄榄苦苷生物合成途径不明确的问题，通过比较转录组学与共表达分析，成功鉴定了负责7-差向-马钱子酸合成的2-氧戊二酸依赖双加氧酶(7eLAS)、橄榄苦苷合成酶(OS)等关键酶，完整解析了从7-脱氧马钱子酸到7-β-1-D-吡喃葡萄糖基-橄榄苷-11-甲酯的生物合成路径，为植物天然产物合成生物学提供了新的酶资源和方法学借鉴。
在地中海文明的饮食文化中，橄榄油占据着举足轻重的地位，而决定其风味和品质的关键成分之一，便是一种名为橄榄苦苷(oleuropein)的酚类裂环烯醚萜酯。这种物质在橄榄果实干重中占比高达6-14%，但其复杂的生物合成途径，特别是从7-脱氧马钱子酸(7-deoxy-loganic acid)到最终产物橄榄苦苷的完整路径，长期以来仍有不少环节悬而未决。传统的酶发现策略往往依赖于同源比对，但在植物次生代谢途径中，催化相似反应的酶可能分属完全不同的蛋白家族，这使得基因筛选工作如同大海捞针。
为了解决这一难题，由Ornella Calderini、Mohamed O. Kamileen、Carlos E. Rodriguez-López等来自意大利国家研究委员会、德国马克斯·普朗克化学生态学研究所等多家机构的研究人员组成的团队，在《Plant Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们独辟蹊径，将“关联推定”与比较转录组学相结合，开发了一种新的基因发现方法，不仅成功填补了橄榄苦苷生物合成路径中的关键空白，还意外地发现了一个催化关键氧化步骤的新型酶家族。
研究人员开展这项研究主要运用了几个关键技术方法：他们对六个橄榄栽培品种果实中果皮在不同成熟阶段的转录组进行了测序分析；整合了来自三个能产生环烯醚萜的植物目（唇形目、龙胆目、山茱萸目）共15个物种的转录组数据，通过直系同源群推断进行跨物种比较共表达分析；利用本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达系统和体外酶活实验对候选基因功能进行验证；并通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)和核磁共振(NMR)对酶促反应产物进行定性与定量分析。
转录组分析揭示橄榄果实成熟过程中的代谢转换
研究人员首先对六个具有不同橄榄苦苷含量的商业橄榄栽培品种的果实中果皮，在成熟和成熟过程中的五个时间点进行了RNA测序。代谢物分析显示，除橄榄苷-11-甲酯(oleoside-11-methyl ester, OME)外，所有测量的代谢物随着果实在树上的成熟而减少。基因表达分析表明，随着果实成熟，与质体MEP途径(甲基赤藓醇途径)相关的基因表达下调，而与胞质MVA途径(甲羟戊酸途径)相关的基因表达上调，这伴随着环烯醚萜类物质（源自MEP途径产生的香叶醇）积累的减少。研究还发现，只有橄榄酸甲酯酶1(EAME1)与环烯醚萜丰度具有较高的相关性，特别是与其上游底物OME呈强负相关。
比较共表达分析锁定候选基因
鉴于早期环烯醚萜途径在菊类植物中共享，研究人员进行了比较共表达分析以减少候选基因数量。他们生成了五个唇形目物种的基因组引导转录组组装，并与菊类植物中其他环烯醚萜生产者的已发表数据整合，共包含15个植物物种。通过分析茉莉花(Jasminum sambac)和欧洲白蜡树(Fraxinus excelsior)的组织表达面板，并利用直系同源关系比较与已知生物合成基因同源物共表达的转录本，他们将候选基因从数万个减少到数百个。最终，通过整合橄榄成熟过程中的差异表达基因，筛选出321个直系同源群，将橄榄候选基因从初始的24,857个DEG减少到789个，其中仅有332个具有Pfam注释。
发现催化7-差向-马钱子酸合成的2-氧戊二酸依赖双加氧酶(7eLAS)
从候选基因中，研究人员测试了注释为2-氧戊二酸依赖双加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenase, ODD)的基因。通过在本氏烟叶片中瞬时表达并饲喂7-脱氧马钱子酸，发现两个ODD（TRINITY_GG_13709_c0_g1_i1和TRINITY_GG_36519_c0_g1_i2）能够消耗底物并立体选择性地产生7-差向-马钱子酸(7-epi-loganic acid)。该活性在大肠杆菌异源表达并纯化的酶体外实验中得到证实。由于该酶活性不同于长春花中报道的细胞色素P450酶7-脱氧马钱子酸羟化酶(7DLH)，因此将其命名为油橄榄7-差向-马钱子酸合成酶1和2(Oe7eLAS1和Oe7eLAS2)。
鉴定7-差向-马钱子酸O-甲基转移酶(7eLAMT)
通过系统发育分析，研究人员从差异表达基因中筛选出一个与唇形目LAMT同源的候选基因(TRINITY_GG_16319_c0_g1_i4)。体外实验表明，该异源表达纯化的蛋白能够以7-差向-马钱子酸为底物，生成7-差向-马钱子苷(7-epi-loganin)，但对7-脱氧马钱子酸没有活性，因此命名为Oe7eLAMT。这表明橄榄中的途径与长春花类似，即7-脱氧马钱子酸先被氧化，再进行甲基化。
表征橄榄苷-11-甲酯葡萄糖基转移酶(OMEGT)
对橄榄果实的LC-MS分析发现了一个与7-差向-马钱子苷和裂马钱子苷(secoxyloganin)高度相关、且碎片模式匹配带有两个己糖的环烯醚萜的色谱峰。研究人员从差异表达基因中筛选出注释为UDP葡萄糖基转移酶(UDPGT)的基因，并通过系统发育分析聚焦于拟南芥UGT75B1/B2所在的L组。候选基因TRINITY_GG_29808_c0_g1_i1在大肠杆菌中异源表达后，其纯化蛋白在体外能够以OME和UDP-葡萄糖为底物，生成与果实中峰值保留时间、m/z和碎片模式匹配的化合物。通过大规模反应和NMR鉴定，确认该产物为7-β-1-D-吡喃葡萄糖基-橄榄苷-11-甲酯(7-β-1-D-glucopyranosyl-oleoside-11-methyl ester, OME-Glc)，相应的酶被命名为OeOMEGT。
鉴定具有橄榄苦苷合成酶(OS)活性的多酚氧化酶(PPO)
研究表明橄榄苦苷可能由橄榄苦苷配基(ligstroside)的羟基酪醇部分氧化产生。研究人员测试了三个在成熟过程中下调表达、注释为多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)的基因。当将含有这些转录本（TRINITY_GG_32073_c0_g1_i1、TRINITY_GG_25161_c0_g1_i1和TRINITY_GG_32052_c0_g1_i1）的农杆菌与橄榄苦苷配基共浸润本氏烟叶片时，均检测到了橄榄苦苷的生成。因此，将这些序列分别命名为橄榄苦苷合成酶1、2和3(OeOS1, OeOS2, OeOS3)。值得注意的是，OeOS2与已报道的OePPO3具有99%的氨基酸同一性。
在本氏烟中重建生物合成途径
尽管未能鉴定出负责OME或OME-Glc向橄榄苦苷配基转化的酶，但研究人员通过在本氏烟中瞬时、顺序表达来自橄榄的7eLAS、7eLAMT、OMES和OMEGT酶，并饲喂初始底物7-脱氧马钱子酸，成功重建了晚期中间产物7-β-1-D-吡喃葡萄糖基-橄榄苷-11-甲酯的生物合成模块。实验证明，这些酶的组合能够顺序地将7-脱氧马钱子酸转化为OME-Glc。
本研究成功解析了油橄榄中橄榄苦苷生物合成途径的关键步骤，发现了一系列新颖的酶，特别是催化关键氧化反应的2-氧戊二酸依赖双加氧酶7eLAS，颠覆了基于长春花研究形成的预期（即该步骤由细胞色素P450催化）。这一发现不仅具有重要的分类学意义，提示了Oleeae和Jasmineae部落中oleoside型裂环烯醚萜特有立体化学的酶学基础，也为代谢工程提供了更易于操作的酶工具。研究所开发的比较共表达分析方法，通过利用日益丰富的植物界表达数据，将候选基因范围大幅缩小，显著提高了基因发现的成功率（对于7eLAS，成功率高达约17%），为解析其他植物天然产物的生物合成途径提供了强大的通用策略。尽管该方法依赖于跨物种共调控的假设，存在一定局限性，但其在整合大数据、进行非靶向酶发现方面的潜力巨大，有望加速人们对植物次生代谢多样性的理解与利用。
