《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Enhancement of therapeutic transgene insertion for treatment of murine phenylketonuria
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本研究针对体内同源定向修复（HDR）效率低下的难题，通过药理学抑制非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导末端连接（MMEJ）通路，显著提升苯丙氨酸羟化酶（PAH）转基因在PAH缺陷小鼠肝脏中的靶向整合效率。研究显示，联合使用香兰素（vanillin）和新霉素（novobiocin）可使血清苯丙氨酸（Phe）水平降低70.6%，并实现近10%的基因组插入率。此外，沙丙蝶呤（sapropterin）辅助治疗进一步将Phe浓度降至392 μM。该策略为单次治疗多种PAH变异所致的苯丙酮尿症（PKU）提供了新思路，凸显了多通路协同调控在基因治疗中的潜力。
基因治疗领域长期以来面临一个关键挑战：如何实现治疗性基因的持久稳定表达。对于像苯丙酮尿症（PKU）这样由数百种不同基因变异引起的遗传病，传统的基因校正工具如碱基编辑器难以广泛应用。PKU患者因苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变导致肝脏PAH酶活性缺失，血液中苯丙氨酸（Phe）积累至神经毒性水平，需终身饮食控制。尽管腺相关病毒（AAV）介导的基因添加疗法已进入临床，但其 episomal（附加体）表达在细胞分裂过程中逐渐丢失，无法实现长期疗效。因此，通过同源定向修复（HDR）将完整的PAH表达盒精准插入基因组，成为有望“一劳永逸”的治疗策略。然而，HDR效率在体内极低，严重制约其临床应用。
为提升HDR效率，研究团队聚焦于调控DNA双链断裂（DSB）的修复路径竞争机制。当CRISPR/Cas9系统在基因组特定位点引入DSB后，细胞可通过非同源末端连接（NHEJ）、微同源介导末端连接（MMEJ）或同源重组（HR）三种主要路径进行修复。其中，NHEJ和MMEJ通常占主导，但易引入突变，而HR虽能精准整合修复模板，却效率低下。本研究创新性地通过药理学抑制NHEJ和MMEJ，迫使细胞优先选择HR路径，从而增强治疗性基因的靶向插入。
研究主要采用以下关键技术方法：
- 1.
利用AAV8载体递送SpCas9核酸酶及含同源臂的PAH修复模板至新生小鼠肝脏；
- 2.
通过腹腔注射小分子抑制剂（香兰素抑制NHEJ，新霉素抑制MMEJ）调控DNA修复路径；
- 3.
使用免疫组化、qPCR及高通量测序（NGS）定量转基因插入效率与PAH表达；
- 4.
引入细胞选择性策略（基于CYPOR shRNA的乙酰氨基酚耐受性筛选）扩增编辑肝细胞；
- 5.
结合血清Phe检测、PAH酶活性分析及稳定同位素呼气试验（13CO2）评估代谢功能恢复。
结果一：NHEJ抑制促进Pah转基因插入
研究首先在PAH完全缺失的Dexon1小鼠模型中验证香兰素的增效作用。通过AAV8递靶向Pah exon 1的修复模板后，香兰素治疗组血清Phe降至916±342 μM（对照组为2132±172 μM），肝PAH酶活性提升至野生型的7.67%，免疫染色显示3.76%的肝细胞表达PAH，qPCR检测到3.91%的等位基因插入率。
结果二：Exon 7位点插入的普适性验证
为开发适用于不同PKU模型的通用策略，团队设计靶向Pah exon 7的修复模板。香兰素辅助的基因插入使血清Phe降至896±325 μM，插入频率达7.44%，证实该策略不依赖特定基因组位点。
结果三：双通路抑制协同增强HDR
联合使用香兰素和新霉素（Vanbiocin方案）后，转基因插入频率提升至9.71%，血清Phe降低70.6%（631±211 μM），小鼠毛色恢复且育龄雌鼠成功繁育。后续口服沙丙蝶呤进一步将Phe降至396±142 μM，接近临床治疗目标值（360 μM）。
结果四：肝细胞选择性扩增的尝试与局限
团队尝试通过CYPOR shRNA赋予编辑肝细胞乙酰氨基酚（APAP）耐受性，以扩增其群体。尽管APAP筛选后雄性小鼠插入频率达9.55%，血清Phe降至425±205 μM，但AAV载体中shRNA序列导致病毒基因组异质性（仅7.8%为完整载体），且引发小鼠运动功能障碍，提示该策略需优化载体设计。
结论与讨论
本研究首次证实通过药理学协同抑制NHEJ和MMEJ可显著提升HDR介导的大片段转基因在体插入效率，为实现PKU的长期治愈提供了新范式。Vanbiocin方案使小鼠代谢功能部分恢复，且对沙丙蝶呤的响应提示基因治疗与药物辅助的协同潜力。然而，shRNA引发的神经毒性及载体生产难题凸显了安全性优化的必要性。未来需进一步探索成人动物中的编辑效率、脱靶效应控制及载体优化，以推动该策略走向临床。此项发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》的研究为多基因变异遗传病的通用型基因治疗奠定了理论基础。
