《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Engineered CRISPR-Cas13a system with enhanced target RNA cleavage activity and reduced collateral activity for therapeutic applications
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本刊推荐：针对CRISPR-Cas13a系统在体应用时存在的旁切活性（collateral activity）限制，研究人员通过结构引导的蛋白工程（Q521R/E796A/E810A三重突变获得enCas13a）与crRNA末端扩展（M1/M3crRNA）协同优化，开发出靶向切割效率提升14.67%且旁切活性受控的新型系统。该系统在内源基因敲低和抗病毒（MuV）应用中表现优异，为RNA靶向治疗提供了更安全高效的工具。
在基因编辑技术飞速发展的今天，CRISPR系统已成为生命科学领域的核心工具。其中，CRISPR-Cas13a作为首个RNA靶向的CRISPR效应器，因其不改变基因组序列的安全性优势，在RNA敲低、病毒检测和抗病毒治疗等领域展现出巨大潜力。然而，其激活后对非靶标RNA的"旁切活性"（collateral activity）如同双刃剑，虽有利于检测灵敏度提升，却严重阻碍了体内治疗应用——在哺乳动物细胞中可能导致细胞毒性，甚至限制宿主生长。
针对这一瓶颈，武汉大学张文霞团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表研究，通过蛋白与crRNA的协同工程，成功构建了靶向切割活性增强且旁切活性受控的升级版CRISPR-Cas13a系统。研究团队首先基于LwaCas13a与LbuCas13a的结构相似性，通过定点突变筛选出三重突变体enCas13a（Q521R/E796A/E810A），其靶向切割效率较野生型提升14.67%，而旁切活性仅轻微增加8%。为进一步抑制旁切效应，他们创新性地对crRNA进行末端修饰，发现5'-U3A（M1crRNA）可增强靶向活性而不影响旁切活性，而5'-U3C结合3'-C4的M3crRNA更能在提升靶向效率的同时显著降低旁切活性。细胞实验表明，enCas13a与M3crRNA组合对内源基因（如高丰度RPL4和低丰度EZH2）的敲低效率均提高10%以上，在抗腮腺炎病毒（MuV）模型中病毒抑制率提升超20%。机制研究表明，突变通过增强蛋白-crRNA结合亲和力（BLI显示KD值降低）及改变复合物构象（AlphaFold预测互作网络扩展）共同提升效能。该研究为CRISPR系统的精准优化提供了可推广的范式。
关键技术方法包括：基于双荧光报告系统（EGFP/mCherry）的高通量活性筛选；结构引导的定点突变与crRNA二级结构预测（RNAfold）；生物层干涉技术（BLI）定量蛋白-RNA结合亲和力；AlphaFold2复合物结构预测与PyMOL分子可视化；qPCR检测内源基因敲低效率与病毒载量（Vero-E6细胞感染模型）。
Engineered LwaCas13a enhances the targeted cleavage efficiency of CRISPR-Cas13a system
通过双荧光报告系统评估12个单点突变体，发现Q521R/K突变显著增强靶向切割，而E796A/E810A突变进一步优化活性。组合突变实验表明三重突变体enCas13a在保持旁切活性可控的前提下最大化靶向效率。
crRNA end extensions affect CRISPR-Cas cleavage efficiency
crRNA末端扩展筛选揭示3'-C3H与5'-U3A修饰可分别调控活性。M3crRNA（5'-U3C+3'-C4）通过结构重排增加与蛋白接触面积，实现靶向活性提升与旁切活性抑制的平衡。
Engineered CRISPR-Cas13a system exhibits superior cleavage activity in mammalian cells
enCas13a-M3crRNA组合在内源基因敲低实验中均优于野生型，对低丰度基因效率提升尤为显著。抗病毒实验证实其对MuV的HN和P基因靶向可降低病毒载量，且细胞毒性检测（CCK-8）显示M3crRNA组存活率最高。
Mechanism exploration of engineered CRISPR-Cas13a systems
BLI动力学分析表明enCas13a与M3crRNA结合亲和力最强（KD值最低）。结构模拟显示突变诱导crRNA构象向蛋白核心靠近，扩展了Q521、E796和E810突变位点周围的氢键网络，从而稳定RNP复合物。
该研究通过多维度优化策略，成功解决了CRISPR-Cas13a系统治疗应用的核心障碍。enCas13a-M3crRNA组合不仅提升了RNA靶向的精准度，更通过降低旁切活性减少了潜在脱靶风险。其协同工程思路可延伸至其他Cas蛋白优化，为遗传病治疗、病毒防控及活细胞RNA成像等领域提供了更可靠的工具。未来需在动物模型中验证其长效安全性，并通过冷冻电镜等手段解析复合物动态变化机制，进一步推动临床转化。
