《Nucleic Acids Research》：Presence of phosphodiester backbone, but not nucleobases, in the guide’s 3′ terminal region is necessary for RISC loading and target cleavage in vitro and in vivo
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本研究针对siRNA治疗剂开发中引导链3'末端结构功能不明确的问题，通过系统性地用非碱基骨架类似物替换末端核苷酸，发现磷酸二酯骨架的存在（而非核碱基）是RISC加载和基因沉默活性的关键决定因素。研究证实C4和2'-O-Me abasic等修饰在体内外均能保持siRNA效能，且骨架疏水性和长度显著影响活性，为siRNA化学工程提供了新方向。
在RNA干扰（RNAi）技术飞速发展的今天，短干扰RNA（siRNA）已成为基因功能研究和疾病治疗的重要工具。然而，天然RNA易被核酸酶降解、易引发免疫反应且细胞摄取效率低等问题，严重限制了其临床应用。尽管化学修饰（如磷硫酰化、2'-O-甲基化）显著改善了siRNA的稳定性和药代动力学性质，但关于其三维结构中各个组分的确切功能，尤其是引导链3'末端区域在RNA诱导沉默复合物（RISC）加载和靶标切割中的作用，仍存在许多未解之谜。传统观点认为，引导链3'末端的核碱基通过与Argonaute 2蛋白的PAZ结构域发生π-π堆积和疏水相互作用，对RISC的初始组装至关重要。然而，近年来的结构生物学研究提示，RISC从加载状态向切割激活状态的转变可能涉及3'末端从PAZ结构域的释放，这表明这些相互作用的功能重要性可能需要重新评估。
为了深入探究引导链3'末端区域（特别是其磷酸二酯骨架和核碱基）在完全化学修饰的siRNA功能中的相对贡献，来自马萨诸塞大学陈医学院和德克萨斯大学医学分支的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了他们的最新研究成果。研究人员设计了两种靶向不同基因（MECP2和HTT）的、具有临床前沿化学修饰模式（包括2'-O-甲基（2'-O-Me）、2'-氟代RNA（2'F-RNA）、5'-(E)-乙烯基膦酸盐（5'-(E)-VP）和磷硫酰化修饰）的不对称siRNA（21核苷酸引导链，16核苷酸乘客链）。他们系统性地将引导链3'末端最后五个位置的核苷酸替换为不含核碱基的类似物，主要包括磷酸二酯连接的丁二醇（C4）间隔基和2'-O-甲基脱碱基核糖（2'-O-Me abasic），并构建了完全无3'突出端的16-mer blunt duplex作为对照。
研究团队运用了几项关键的技术方法来评估这些修饰siRNA的功能。首先，通过固相亚磷酰胺法化学合成所有寡核苷酸，并利用高效液相色谱（HPLC）和质谱（LC-MS）进行纯化和鉴定。其次，在HeLa细胞系中通过游离摄取（free uptake）实验进行体外浓度-效应曲线分析，使用QuantiGene Singleplex assay精确量化靶基因mRNA（MECP2和HTT）的沉默水平以评估siRNA的效价（IC50）和效能。第三，采用蛇毒磷酸二酯酶（SVPD）介导的3'-核酸外切酶降解实验来评估不同3'末端修饰对引导链稳定性的影响。最后，在FVB/NJ雌性小鼠模型中进行了体内药效学验证，通过皮下注射给药，两周后采集肌肉和心脏组织，同样使用QuantiGene方法检测靶标mRNA的敲低效率，以确认体外发现的体内相关性。
3'末端C4修饰在不同序列中的兼容性
研究人员首先评估了将引导链3'末端一个至五个位置的2'-O-Me核苷酸替换为C4间隔基的效果。结果表明，对于siMECP2和siHTT两种序列，引入多个C4修饰在很大程度上是可行的。特别是将全部五个核苷酸替换为C4间隔基（5xC4）时，其沉默活性（siMECP2 IC50= 82 nM；siHTT IC50= 54 nM）与全部为2'-O-Me修饰的对照组（siMECP2 IC50= 91 nM；siHTT IC50= 59 nM）相当，证明了核碱基在这些位置的缺失并不影响siRNA的核心功能。
3'末端突出端的结构对体外活性的影响
为了明确3'末端突出端本身的重要性，研究团队构建了完全无突出端的16-mer blunt duplex。结果显示，其活性显著降低（siMECP2 IC50= 493 nM），远逊于具有五核苷酸突出端的对照组。然而，当在blunt duplex的末端接上五个磷酸二酯连接的C4间隔基（即恢复骨架长度但不引入核苷酸结构）后，活性得到大幅恢复（siMECP2 IC50= 82 nM），甚至优于2'-O-Me abasic修饰（IC50= 220 nM）。这一关键实验证明，维持磷酸二酯骨架的连续性和适当长度对于RISC加载和功能至关重要，而核碱基的存在并非必需条件。
3'末端突出端长度的最低要求
研究人员进一步探索了维持活性所需的3'末端最短长度。通过逐步减少C4间隔基的数量发现，对于siMECP2序列，拥有五、四或三个C4间隔基均能保持较好的活性，但当减少到两个或一个时，效价和效能则急剧下降。这一趋势在siHTT序列中也得到印证，表明3'末端区域的长度是决定siRNA效价的一个关键参数。
非核苷酸/非碱基结构增强核酸酶稳定性
在去除磷硫酰化修饰（仅保留天然磷酸二酯骨架）的条件下，研究人员评估了不同3'末端修饰对引导链稳定性的影响。结果显示，含有五个2'-O-Me或为16-mer的引导链极易被蛇毒磷酸二酯酶（SVPD）降解（半衰期约0.6-0.9小时）。相比之下，3'末端为五个C4或2'-O-Me abasic修饰的引导链表现出显著的稳定性提升，半衰期延长至约7.5小时，提高了约8倍。这表明移除核碱基本身就能作为一种有效的策略，通过干扰核酸酶的识别来增强寡核苷酸的稳定性。
非核苷酸/非碱基结构在体内的功能性
体内研究进一步证实了体外发现的可靠性。通过给小鼠皮下注射二十二烷酸（DCA）偶联的siRNA，研究人员发现，在肌肉和心脏组织中，3'末端为C4或2'-O-Me abasic修饰的siRNA（针对Mecp2和Htt mRNA）均能产生与2'-O-Me对照组相当甚至更优的基因沉默效果。而无突出端的16-mer blunt construct则几乎无效。这雄辩地证明了不含核碱基的骨架修饰在活体动物体内同样能够支持高效的RISC功能和基因沉默。
间隔基化学性质的深刻影响
研究还深入探讨了骨架连接单元的化学性质（疏水性）和长度对活性的影响。系统比较不同长度的碳链（C2, C3, C4, C6）和聚乙二醇链（TRIG, TEG, HEG）后发现，疏水性和长度共同决定了siRNA的活性。过长的碳链（如C6）或过于亲水的长链（如HEG）会降低效价，而适中长度和疏水性的连接子（如C2-C4, TRIG）则能保持良好的活性。这表明磷酸基团之间的精确距离以及局部环境的亲疏水性质对于其与Argonaute 2蛋白的有效相互作用至关重要。
本研究得出的核心结论是，在完全化学修饰的siRNA引导链3'末端区域，磷酸二酯骨架的存在是支撑RISC加载和靶标切割活性的决定性因素，而核碱基则并非必需。这一发现挑战了基于早期结构生物学所提出的、关于PAZ结构域与核碱基相互作用至关重要的传统观点，与近期发现的RISC激活过程中PAZ域释放模型更为契合。该研究的意义重大且深远：首先，它揭示了通过合理设计非碱基骨架修饰来优化siRNA活性的新途径，为siRNA的化学工程开辟了更广阔的空间，例如可以引入具有特定理化性质的间隔基来精细调控其与蛋白的相互作用、药代动力学和组织分布。其次，移除核碱基作为一种增强核酸酶稳定性的新策略，与传统的磷硫酰化修饰形成互补，为改善治疗性寡核苷酸的耐久性提供了更多选择。此外，这些发现很可能具有普适性，其原理可推广至其他类型的RNAi工具（如CRISPR相关RNA）或治疗性寡核苷酸（如反义寡核苷酸）的设计中，特别是在需要精确控制引导序列长度和结构的应用场景。总之，这项工作不仅深化了我们对RNAi机制中分子识别的理解，也为开发下一代高效、稳定的核酸药物奠定了重要的化学基础。
