《Molecular Biology and Evolution》：Mitochondrial Retrograde Control of Transcription Evolves with Respiratory Stress, Metabolic Adaptation, and Virulence in Budding Yeasts
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本研究针对线粒体逆行调控通路在酵母菌中的进化与功能多样性展开研究。研究人员通过比较基因组学、染色质免疫沉淀测序和电泳迁移率变动分析等技术，系统解析了白色念珠菌中Rtg1/Rtg3转录因子调控网络对呼吸应激的响应机制。研究发现该通路通过调控替代氧化酶AOX2等靶基因，在代谢适应和氧化应激反应中发挥关键作用，为理解真菌致病性进化提供了新视角。该成果发表于Molecular Biology and Evolution。
在真核细胞中，线粒体作为能量代谢的中心细胞器，其功能状态需要通过复杂的信号传导机制与细胞核进行沟通。这种被称为"逆行调控"的通信系统在维持细胞稳态中起着至关重要的作用。在酿酒酵母中，Rtg1和Rtg3转录因子组成的异源二聚体是逆行信号通路的核心组成部分，通过调控三羧酸循环相关基因的表达来响应线粒体功能异常。然而，随着对不同酵母物种研究的深入，科学家们发现这一调控系统在进化过程中可能发生了显著的功能分化。
白色念珠菌作为一种重要的人类致病真菌，其代谢特性与酿酒酵母存在明显差异。与偏好发酵的酿酒酵母不同，白色念珠菌更倾向于有氧呼吸，且无法在不含完整线粒体DNA的情况下存活。这种代谢差异使得研究者对白色念珠菌中逆行调控通路的功能产生了浓厚兴趣。早期研究表明，白色念珠菌中的Rtg1和Rtg3同源蛋白参与了半乳糖代谢和致病性等过程，但它们在响应线粒体功能障碍方面的具体功能尚不清楚。
本研究通过整合实验生物学和比较基因组学方法，系统探讨了Rtg信号通路在芽殖酵母亚门中的进化历程，特别是在白色念珠菌中对该通路的靶基因和调控机制进行了深入研究。研究人员发现，尽管白色念珠菌与酿酒酵母的Rtg通路在响应线粒体呼吸缺陷方面具有相似的整体功能，但其调控的靶基因库却存在显著差异。这一发现为了解转录调控网络的进化提供了重要线索。
为了开展这项研究，研究人员运用了多项关键技术：通过染色质免疫沉淀测序在呼吸缺陷型白色念珠菌菌株中全基因组范围鉴定Rtg1结合位点；利用电泳迁移率变动实验验证转录因子与靶基因启动子的直接结合；采用荧光显微镜观察Rtg蛋白的亚细胞定位；通过蛋白质印迹分析检测Rtg蛋白表达水平的变化；并对1154个酵母菌株的基因组数据进行比较基因组学分析，追溯Rtg通路组件的进化历史。所有分析的酵母基因组数据来源于Opulente等人2024年发表的大规模测序结果。
CaRtg1/CaRtg3转录因子二聚体结合在CaAOX2近端启动子区域
研究人员首先通过Northern印迹分析发现，在呼吸缺陷的△Caaep3突变株中，诱导型替代氧化酶基因CaAOX2的表达显著上调，而这种上调在△Cartg1和△Cartg3突变株中被明显削弱。特别是在加入H2O2诱导氧化应激的条件下，CaRtg1/CaRtg3对CaAOX2表达的调控作用更为明显。通过电泳迁移率变动实验，研究团队证实CaRtg1/CaRtg3二聚体能够结合到CaAOX2启动子区域的GTCA基序和非经典的E-box序列上，表明这些转录因子直接调控CaAOX2的表达。
通过ChIP-seq和EMSA鉴定C. albicans中响应线粒体呼吸功能障碍的Rtg通路靶基因
为了全面揭示白色念珠菌中Rtg通路的靶基因，研究人员在两种不同的呼吸缺陷型菌株（△Cappr13和△Caaep3）中进行了染色质免疫沉淀测序分析。结果显示，在△Caaep3菌株中有75个基因的启动子区域显著富集，而在△Cappr13菌株中有25个基因的启动子区域富集，其中15个基因是共有的。MEME-ChIP分析在这些富集序列中检测到了经典的CARbox motif。通过电泳迁移率变动实验验证，研究人员确认了多个新发现的靶基因，包括编码外周NADH脱氢酶的CaNDE1、参与乙醛酸循环的苹果酸合酶基因CaMLS1、与线粒体自噬相关的CaPTC6、CaMDM34和CaPEX11，以及编码硫氧还蛋白的CaTRX1等。
CaRtg1/CaRtg3二聚体的组成型核定位依赖于磷酸化的CaRtg3
与酿酒酵母中Rtg蛋白的核质穿梭不同，本研究发现白色念珠菌中的CaRtg1和CaRtg3在呼吸正常和缺陷的细胞中均持续定位在细胞核内。CaRtg3在缺乏CaRtg1的情况下仍能保持核定位，而CaRtg1在缺乏CaRtg3时则出现核外定位。通过将CaRtg3中的六个已知磷酸化丝氨酸位点突变为丙氨酸，研究人员发现这些磷酸化位点对CaRtg1/CaRtg3二聚体的核共定位至关重要，表明磷酸化调控在白色念珠菌Rtg通路中扮演着重要角色。
CaRtg1和CaRtg3转录因子可能通过调节其蛋白水平来调控
在缺乏Rtg2和Mks1等调控因子的白色念珠菌中，Rtg通路的激活机制可能与酿酒酵母不同。蛋白质印迹分析显示，在呼吸缺陷菌株中，CaRtg1-HA的蛋白水平显著升高，而CaRtg3-HA的水平在△Cappr13菌株中降低，但在△Caaep3菌株中变化不明显。这一发现表明，白色念珠菌可能通过调节转录因子本身的表达水平，特别是增加CaRtg1的表达，来激活对呼吸功能障碍的逆行响应。
逆行转录因子Rtg1和Rtg3源于Saccharomycotina进化过程中的一次基因复制事件
通过对1154个酵母菌株基因组的比较分析，研究人员发现Rtg1和Rtg3的直系同源物存在于绝大多数（98%）芽殖酵母中。系统发育分析表明，Rtg1和Rtg3源于一次基因复制事件，该事件发生在芽殖酵母亚门进化过程中，位于基础分支（Lipomycetales、Trigonopsidales和Dipodascales）与其他谱系分离之后。值得注意的是，在三个基础分支中只存在单个Rtg同源物，而其他所有分支中都存在Rtg1和Rtg3两个直系同源物。
逆行通路的调控因子Rtg2和Mks1是古老的蛋白质，在Serinales进化过程中丢失
与酿酒酵母不同，白色念珠菌中缺乏Rtg2和Mks1的直系同源物。系统发育分析表明，这两种调控因子在芽殖酵母亚门中是祖先存在的，但在Serinales目的大部分成员（包括白色念珠菌和C. parapsilosis）的进化过程中一次性丢失。只有Serinales目基部分支的6个物种仍保留有Rtg2和Mks1直系同源物。
替代氧化酶在Saccharomycotina进化过程中多次丢失和复制
研究人员发现，替代氧化酶在芽殖酵母中广泛存在（73%的物种），可能是最后共同祖先的特征。与线粒体复合体I的存在密切相关——233个物种同时具有复合体I和AOX，79个物种两者皆无。AOX基因在进化过程中经历了多次独立的复制事件，特别是在Serinales目中发现了至少13次独立的复制事件。白色念珠菌中的两个AOX旁系同源物（组成型Aox1和诱导型Aox2）就是其中一次复制事件的结果。
S. cerevisiae中Rtg通路的典型靶基因是祖先存在且大多保守的基因，具有复杂的旁系同源扩展和丢失历史
对酿酒酵母中已知的Rtg通路靶基因（如CIT1、ACO1、IDH1/2等）的分析表明，这些基因在芽殖酵母中普遍保守，但经历了复杂的进化历史。大多数物种拥有多个旁系同源副本，经历了多次基因丢失和复制事件。
C. albicans中受Rtg通路控制的基因在大多数Saccharomycotina中保守
本研究新发现的白色念珠菌Rtg调控靶基因在芽殖酵母亚门中大多保守且可能是祖先存在的，如MLS1、NDE1、PTC6等基因在几乎所有测序的菌株中都能找到直系同源物。
本研究揭示了芽殖酵母中线粒体逆行信号通路的进化历程和功能多样性。尽管白色念珠菌和酿酒酵母的Rtg通路在响应线粒体功能障碍方面具有保守的整体功能，但其具体的靶基因库和调控机制存在显著差异。这种差异反映了两种酵母在代谢特性和生态适应方面的不同策略。
研究表明，Rtg通路起源于芽殖酵母亚门内部的一次基因复制事件，该事件产生了Rtg1和Rtg3两个旁系同源转录因子。在白色念珠菌所在的Serinales目进化过程中，该通路丢失了Rtg2和Mks1等关键调控因子，转而可能通过调节转录因子蛋白水平和磷酸化状态来激活通路。这种调控机制的转变与白色念珠菌中Rtg蛋白的组成型核定位特征相一致。
从功能角度来看，白色念珠菌中的Rtg通路通过调控替代氧化酶、抗氧化应激基因和线粒体自噬相关基因等，在应对呼吸缺陷引起的氧化应激中发挥核心作用。这一功能适应与白色念珠菌的致病性密切相关，因为线粒体功能与真菌的感染能力存在密切联系。
该研究不仅增进了我们对真菌中线粒体核信号通路的理解，还展示了转录调控网络在进化过程中的可塑性。在保持核心功能保守的同时，调控网络的具体组成部分和靶基因库可以随着物种的生态和生理适应而发生显著变化。这种"功能保守但组件可变"的进化模式为理解复杂生物学系统的演化提供了重要见解。
未来研究需要扩展到更多酵母物种，特别是基础分支的代表物种，以全面揭示Rtg通路的起源和功能演化。此外，白色念珠菌中Rtg通路的具体调控机制仍有待阐明，特别是在缺乏Rtg2和Mks1的情况下，如何精确控制通路活性的分子机制尚需进一步探索。
