机械记忆与NF-κB信号通路在牙髓干细胞向成牙细胞分化中的作用

《Journal of Endodontics》：Mechanical Memory and NF-κB Signaling in Dental Pulp Stem Cell Odontogenic Differentiation

基质刚度与维度调控牙髓干细胞（DPSCs）的干细胞特性、衰老及成牙骨质分化，2kPa软基质促进早期分化并抑制衰老，3D环境延迟分化但增强表观遗传调控与DNA修复，NF-κB信号介导机械记忆与炎症-间充质细胞互作。

　　

Maryam Ghaffari | Annie Shrestha

多伦多大学牙科学院，加拿大安大略省多伦多市爱德华街124号，邮编M5G 1G6

摘要

引言

本研究旨在探讨基底材料的硬度和维度如何调节牙髓干细胞（DPSCs）的干性、衰老过程及其后续的牙源性分化。此外，还研究了启动期与牙源性诱导之间的相互作用，并阐明了NF-κB信号通路在此过程中的作用。

方法

我们制备了具有可调硬度的机械变体PDMS基底材料（硬度范围为2kPa至50kPa），用于2D和3D培养。将DPSCs在这些基底材料上培养7天后，诱导其进行牙源性分化。分析方法包括基因表达检测、免疫荧光成像以及基质矿化观察。

结果

2kPa硬度的基底材料显著促进了早期牙源性分化，表现为DMP-1和DSPP基因的表达上调，同时干性标志物（NANOG、SOX-2）的表达也增强。这种条件减少了细胞衰老，并促进了NF-κB在细胞核和细胞质中的分布，表明基底材料对细胞高效分化具有启动作用。相比之下，3D基底材料虽然诱导了牙源性分化，但过程较为缓慢且更为显著；同时观察到表观遗传调控（如HAT-1、HDAC-1）的增加以及XRCC5基因的表达升高，这表明细胞处于活跃的DNA修复状态，且衰老程度处于中等水平，并随时间趋于稳定。

结论

柔软的基底材料（2kPa）有助于保持细胞的干性并促进早期分化，而3D环境则更有利于晚期分化及细胞衰老的平衡。这些发现强调了启动期和基底材料维度在优化基于MSC的再生治疗中的重要性。

引言

再生性根管治疗（REPs）的目标是通过招募或移植能够增殖、抵抗衰老并分化为功能性成牙本质细胞的干细胞来修复牙本质-牙髓复合体。间充质干细胞（MSCs），包括牙髓干细胞（DPSCs），在生物化学和机械信号的刺激下可分化为成牙本质细胞。在发育、修复和疾病过程中，细胞外机械环境会动态变化，从而影响细胞的静止状态、干性、衰老过程及分化方向¹。例如，在较硬的基底材料（约3GPa）上，MSCs倾向于向成骨细胞方向分化；而在较软的基底材料（约kPa）上，则更倾向于向脂肪细胞方向分化²。先前的研究还描述了“机械记忆”现象，即过去的机械刺激会影响细胞后来的命运³，但在再生性根管治疗中，移植的细胞在整个启动和分化过程中始终处于相同的支架环境中。因此，所谓的“机械记忆”实际上反映了持续的机械转导过程。机械转导由肌球蛋白马达、肌动蛋白纤维和 focal adhesions 组成的系统驱动，该系统整合基底材料的硬度信息以调节细胞骨架的张力⁴。在硬基底材料上，肌动蛋白应力纤维会导致细胞核变形，扩大核孔，从而促进转录因子的进入。这种核变形具有可逆性和持久性，即使机械刺激停止后，这种影响仍会持续存在⁵。核变形与机械转导的持久性之间的相互作用揭示了细胞将机械信号转化为长期功能结果的复杂生物物理机制。细胞间的相互作用，尤其是通过N-钙粘蛋白（一种细胞间粘附蛋白）的介导，可以调节甚至消除硬基底材料的不利影响⁶。 NF-κB（核因子κ-light-chain-enhancer of activated B cells）信号通路调节炎症、免疫反应和细胞分化，对MSC的分化具有复杂的、依赖于具体环境的调控作用。其双重作用取决于细胞类型、分化阶段和环境因素。TNF-α或TLR配体激活NF-κB后，可通过TAZ和BMP-2促进成骨分化⁷，同时激活Runx2和Osterix等关键转录因子，这些因子对成骨细胞的形成和基质矿化至关重要⁸。相反，经典的NF-κB信号通路（由IKKβ介导）会抑制成骨基因的表达，并通过降解β-连环蛋白破坏Wnt/β-连环蛋白通路，从而阻碍成骨细胞分化⁹。NF-κB的作用会受到炎症和机械应力的影响，这些因素可能促进或抑制成骨过程¹⁰¹¹。基础性的成骨过程可以在没有NF-κB参与的情况下发生，这表明NF-κB的作用更多是调节性的而非必需的⁸。进一步研究不同机械条件下NF-κB的动态变化及其与环境的特异性相互作用对于再生性根管治疗至关重要，因为这类治疗发生在炎症环境中，且依赖于免疫系统与间充质细胞的相互作用。 尽管在MSC机械生物学领域已有大量研究，但基底材料的硬度、维度以及启动期如何调节DPSCs的牙源性分化仍不明确，尤其是在启动期到诱导期的转变过程中。这一空白对于再生性根管治疗尤为重要，因为成功的牙本质-牙髓再生需要维持细胞的干性、控制衰老过程、促进及时的成牙本质细胞分化，并适当调节NF-κB相关的炎症反应，而目前的临床材料在这方面存在不足。通过系统地改变基底材料的力学性质和维度，本研究探讨了柔软与坚硬基底材料、2D与3D环境如何通过启动期和NF-κB信号通路影响DPSCs的命运。这些机制层面的发现有助于指导下一代生物材料的设计，以创造能够支持可预测、整合性牙本质-牙髓再生的微环境。

机械可调硅基底的制备

机械可调硅基底的制备

我们按照先前建立的方案¹²，通过将末端带有乙烯基的PDMS与铂催化剂（SYLGARD?）混合来制备2D聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底材料，通过调整基底材料与固化剂的比例来调节硬度（图1B）。50 kPa硬度的基底材料（2D-50 kPa）采用0.3的固化比例制备，而2 kPa硬度的柔软基底材料（2D-2 kPa）则采用1.2的固化比例制备。混合均匀后进行脱气处理2分钟，然后浇铸到培养容器中。

基底材料的力学和物理特性

这种可调PDMS基底培养系统能够制备出杨氏模量在2kPa±0.5kPa至50kPa±2kPa范围内的2D结构，通过调整基底材料与固化剂的比例来实现（图1B）。3D支架的杨氏模量为22kPa±5kPa。商业化的PDMS材料通常被认为具有非多孔性且耐水解降解，能在细胞培养中保持稳定的力学性能¹³。与这些报道一致，我们未观察到任何明显的基底材料膨胀现象。

讨论

生物材料的性质，如几何形状、表面拓扑结构和力学特性，会影响DPSCs的增殖、干性和分化。虽然硬度对成骨过程有显著影响（MSCs更倾向于在较硬的基底材料上分化¹⁴），但硬度并不能完全解释细胞的行为；基质的孔隙率也会影响细胞反应¹⁵。例如，DPSCs在PDMS基底上的生长情况与在同等硬度的聚丙烯酰胺基底上的生长相似¹⁶，超软的PDMS基底对细胞粘附和分化过程的干扰较小。

结论

本研究强调了基底材料的力学性质、维度以及NF-κB信号通路在调节DPSCs牙源性分化、衰老过程和干性方面的关键作用。柔软的基底材料（尤其是2kPa硬度的基底）不仅保持了细胞的干性，还促进了早期牙源性分化，表现为相关标志物的表达上调和细胞衰老程度的降低。这些发现突显了启动期在促进牙源性分化中的重要作用。机械信号、信号通路和细胞行为之间的相互作用共同决定了细胞的最终命运。

致谢

作者感谢多伦多大学的Laurent Bozec博士在3D基底材料力学测试方面提供的支持。同时感谢多伦多大学CAMiLoD（Collaborative Advanced Microscopy Labs of Dentistry）的Jian Wang在力学测试和扫描电子显微镜技术方面的专业建议。共聚焦显微镜成像工作是在The Hospital for Sick Children（SickKids）的成像设施中完成的。本研究得到了美国牙科协会（American Association of...）的研究资助。