《Journal of Ethnopharmacology》：Zhi-Gan Formula improved insomnia and anxiety comorbidity in a mouse model via PACAP signaling in the medial prefrontal cortex
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中药复方智甘方通过恢复前额叶皮层突触可塑性调控失眠-焦虑共病，其机制涉及PACAP-eEF2-BDNF信号通路。
刘瑞毅|吴章杰|尹颖|宋成浩|张成宇|邢山|谭敬文|傅珍珍|黄恩嘉|邓明雪|韩明志|彭宇涵|吴长宇|谢慧军|陈刚
济南大学脑疾病个性化医学跨学科研究所，中国广州510632
摘要
民族药理学意义
失眠和焦虑具有高度共病性，严重影响了生活质量。目前针对这两种情况的药物干预效果仍然有限。志 Gan 方剂（ZG）由志志池煎剂和甘麦大枣煎剂组成，这两种经典的中药方剂在临床中被广泛用于治疗失眠或焦虑，显示出作为治疗失眠-焦虑共病的治疗选择的潜力。研究目的
本研究旨在评估 ZG 的促眠和抗焦虑效果，并探讨垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）在中前额叶皮层（mPFC）中调节共病性睡眠和焦虑的机制。材料与方法
小鼠接受了 4-氯-DL-苯丙氨酸（PCPA）注射，随后给予 ZG 或地西泮。行为通过戊巴比妥诱导的睡眠测试、开放场测试（OFT）和升高加迷宫测试（EPM）进行评估。关键通路通过网络药理学分析确定，并通过长时程增强（LTP）记录和蛋白质定量进行验证。病毒介导的 PACAP 副作用载体被转染到 mPFC 中。结果
PCPA 注射引发了类似失眠和焦虑的行为。连续三天给予 ZG 可显著缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间并缓解类似焦虑的行为，而地西泮仅部分改善了类似焦虑的行为。网络药理学分析表明 ZG 参与了神经肽-受体相互作用和突触传递通路。突触可塑性的评估显示，ZG 改善了 mPFC 的 LTP 以及模型小鼠中受损的突触蛋白（PSD95、突触素-1、BDNF）的表达。此外，ZG 还提高了神经肽 PACAP 及其下游 eEF2 信号通路对突触蛋白合成的作用。关键的是，在睡眠剥夺的小鼠 mPFC 脑切片中灌注 PACAP 激动剂可以恢复 LTP 的缺陷。最后，mPFC 中 PACAP 的下调消除了 ZG 的治疗效果和突触蛋白的表达增强效应。结论
ZG 通过 PACAP-eEF2-BDNF 通路恢复 mPFC 的突触可塑性，从而缓解了失眠-焦虑共病，这可能为治疗睡眠-焦虑共病提供新的方法。引言
失眠是一种常见的睡眠障碍，影响全球约 10%–30% 的人口，其特征是难以入睡、维持睡眠或早醒，并伴有日间功能障碍（Baldwin 等，2013；Bresser 等，2025；Schroeck 等，2016）。失眠与焦虑障碍有很高的共病率：流行病学数据显示，约 50% 的失眠患者表现出焦虑症状，而失眠本身也是焦虑障碍的独立风险因素（Chellappa & Aeschbach，2022；Hertenstein 等，2019）。现有的失眠伴焦虑的临床方法仍然有限：苯二氮卓类药物（如地西泮）和非苯二氮卓类药物可以缩短睡眠潜伏期，但改善焦虑的效果不佳，且存在依赖性和认知功能障碍的风险（Baldwin 等，2013；Gallacher 等，2012；Huedo-Medina 等，2012；R?sner 等，2018）。抗抑郁药（如曲唑酮）或褪黑激素激动剂对共病的治疗效果也有限（Fagiolini 等，2023；Srinivasan 等，2012）。因此，开发具有促眠和抗焦虑双重作用的治疗策略非常重要。
中药因其多组分和多靶点的特性，在治疗失眠及其共病方面得到广泛应用，其潜在优势有待进一步探索。志志池煎剂和甘麦大枣煎剂均出自最具影响力的中药著作《伤寒杂病论》，具有缓解烦躁或诱导镇静的作用。这两种方剂在临床中广泛用于治疗失眠和/或焦虑（Mao & Zeng，2008；Tian 等，2015）。它们的组合——志 Gan 方剂（ZG）包含五种草药：栀子果（Zhizi，Gardenia jasminoides Ellis 的干燥成熟果实，使用其原始形态）、大豆炮制品（Dandouchi，Glycine max (L.) Merr. 的干燥成熟种子的发酵加工产品，使用其原始形态）、小麦轻果（Fuxiaomai，Triticum aestivum L. 的干燥皱缩果实，使用其原始形态）、枣果（Dazao，Ziziphus jujuba Mill. 的干燥成熟果实，使用其原始形态）以及甘草根及根茎（Gancao，Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的干燥根和根茎，经过蜂蜜处理）。所有草药均来自《中国药典》（2020 年版），所有植物名称均经过 World Flora Online 验证。临床研究表明，ZG 可提高患者的睡眠质量，且无显著不良反应（Mao & Zeng，2008）。此外，这些草药成分还显示出抗焦虑潜力（Mustafa 等，2025；Wang 等，2020）。鉴于目前治疗和预防失眠及焦虑复发需要长期用药，ZG 作为一种源自经典中药方剂的制剂，非常适合解决共病问题，并为揭示其潜在机制提供了机会。
前额叶皮层在调节睡眠-情绪稳态中起着关键作用。越来越多的证据表明，慢性失眠患者的前额叶皮层对边缘系统的调节能力减弱（Shen 等，2024）。前额叶突触可塑性的功能障碍，即通过改变神经元突触强度和结构来适应环境变化的能力，可能与失眠和情绪障碍密切相关（Hong 等，2023；Meng & Wang，2023；Salas 等，2014；Zhou 等，2017）。垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）是一种广泛分布于中枢神经系统的神经肽，对睡眠和焦虑具有调节作用（Cui 等，2025；Rajbhandari 等，2023）。PACAP 迅速抑制 eEF2 信号通路，从而上调与突触可塑性相关的蛋白质表达，增强神经可塑性（Zhang 等，2024）。然而，尚需确定 PACAP 是否在中前额叶皮层（mPFC）中调节共病性睡眠和焦虑的突触可塑性。
本研究旨在评估 ZG 在小鼠模型中治疗失眠-焦虑共病的效果，并阐明 mPFC PACAP 神经可塑性信号传导的潜在机制。通过使用网络药理学分析、蛋白质表达测量、长时程增强（LTP）电生理记录和病毒介导的 PACAP 副作用等方法，研究发现 ZG 通过 PACAP 依赖的 eEF2/BDNF 通路恢复 mPFC 突触可塑性，从而缓解了失眠-焦虑共病。
Zhi-Gan 方剂（ZG）的制备
实验用中药由甘肃三龙安康药业有限公司（中国甘肃省天水市）提供。ZG 包含五种草药：栀子果（Zhizi，Gardenia jasminoides Ellis 的干燥成熟果实，使用其原始形态）、大豆炮制品（Dandouchi，Glycine max (L.) Merr. 的干燥成熟种子的发酵加工产品，使用其原始形态）、小麦轻果（Fuxiaomai，Triticum aestivum L. 的干燥皱缩果实，使用其原始形态）
ZG 成分的 LC-MS 分析
正负电喷雾离子化（ESI）模式的液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示了 ZG 的复杂化学组成（图 1）。基峰色谱图在 30 分钟的洗脱梯度中显示出多个分离的峰。通过保留时间（RT）和分子离子检测，鉴定出关键成分，包括柠檬酸（RT 2.72 分钟）、新绿原酸（RT 8.12 分钟）、山栀苷甲酯（RT 10.39 分钟）、槲皮素（RT 12.97 分钟）等讨论
本研究旨在阐明 ZG 方剂缓解失眠和类似焦虑行为的潜在机制。首先，低剂量的 ZG 在 PCPA 模型小鼠中连续三天使用后，可缩短睡眠潜伏期、延长睡眠时间并缓解类似焦虑的行为。相比之下，地西泮仅改善了睡眠，对类似焦虑的行为影响甚微。网络药理学表明其涉及神经信号转导和突触可塑性结论
本研究表明，ZG 方剂通过改善前额叶 PACAP-eEF2/BDNF 信号通路，从而修复突触可塑性损伤，缓解了失眠和焦虑（图 8）。与地西泮相比，ZG 在治疗失眠-焦虑共病方面表现出潜在优势。该研究创新性地揭示了 PACAP 作为调节前额叶突触可塑性的关键枢纽，表明针对 PACAP 信号通路可能是治疗共病性失眠的新策略CRediT 作者贡献声明
邢山：验证、研究。张成宇：方法学、研究、正式分析、数据管理。陈刚：写作——审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源管理、项目管理、研究、资金获取、概念化。宋成浩：写作——初稿撰写、验证、研究。谢慧军：写作——审稿与编辑、验证、研究、概念化。尹颖：写作——初稿撰写、验证未引用的参考文献
Bandelow 等，2013；Tsugawa Y 等，2018。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
资金来源
本研究得到了
国家自然科学基金（82174002、82074305）的支持。
利益冲突声明
作者声明与本文无关的任何商业或财务关系不会构成潜在的利益冲突。
致谢
无需要声明的内容。
