锚定在氮化碳上的单原子铜纳米酶，具有增强的过氧化物酶样活性，可用于食品borne病原体的比色检测

《Journal of Hazardous Materials》：Single-Atom Cu nanozyme anchored on carbon nitride with enhanced peroxidase-like activity for colorimetric detection of foodborne pathogens

纳米酶催化性能与免疫磁检测技术结合用于沙门氏菌检测，通过超分子自组装和热解法制备高负载铜单原子纳米酶Cu-SA-CN，具有优异过氧化物酶样活性，构建的免疫磁显色传感器检测限低至12.7 CFU/mL，线性范围广且稳定性强，成功应用于鸡肉样本检测。

　　

郭丰宇|雷华|杨倩|金娜娜|张新阳|林建涵|胡瑞兵|周宝成|王文|杨华|董晓萍

化学与化学工程学院，浙江省聚合物材料表面与界面科学重点实验室，浙江科技学院，杭州310018，中国

摘要

基于纳米酶的比色生物传感器在检测食源性病原体方面具有很大潜力，但其灵敏度往往受到纳米酶探针催化性能不足的限制。本文采用一种新型的超分子自组装和热解策略，制备了一种锚定在碳氮化物（Cu-SA-CN）上的铜单原子纳米酶，其铜负载量为24.1 wt%。该材料具有原子级分散的Cu-N₃位点，并表现出优异的过氧化物酶活性（V_max = 51.4×10^-8M/s），能够高效催化H₂O₂生成活性氧（ROS）。利用Cu-SA-CN丰富的表面氨基基团进行抗体偶联，并凭借其高活性实现信号放大，构建了一种用于检测鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）的灵敏免疫磁比色生物传感器。该传感器具有12.7 CFU/mL的检测限，线性范围为3.8×10¹ – 3.8×10⁶ CFU/mL。重要的是，该传感器表现出优异的长期稳定性。在实际鸡样本中的应用证明了其实用性。这项工作不仅提供了一种制备高性能单原子纳米酶的有效策略，还为复杂食品基质中病原菌的灵敏和特异性检测提供了新的方法。

引言

食源性病原体对全球公共卫生构成了严重且广泛的威胁，每年导致数百万人患病并造成巨大的经济损失[1][2]。因此，快速、准确和高效地检测这些病原体对于减轻食源性疾病和确保食品安全至关重要[3][4]。尽管传统的检测技术（如平板计数[5][6]、聚合酶链反应（PCR）[7][8]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[9][10]具有可接受的准确性和灵敏度，但它们通常受到检测时间较长、操作复杂性和成本较高的限制。这些局限性凸显了迫切需要开发快速、灵敏且经济高效的新型检测方法，以更好地保护公众健康和确保食品安全。 近年来，随着纳米技术和生物传感器的进步，出现了许多新的检测方法。其中，比色检测因其操作简单、响应迅速和成本低廉而受到广泛关注[11][12][13][14]。比色检测的关键要素是使用模拟酶的催化剂来生成可见信号[15]。纳米酶作为一种有前景的替代品，因其可调的催化性质、优异的稳定性和成本效益而受到重视[16][17][18]。然而，传统纳米酶的结构异质性和聚集的活性位点导致原子利用率不高，从而影响了其催化性能，限制了其在比色检测中的应用[19][20][21]。 单原子纳米酶（SAzymes）是将金属原子原子级分散在支撑基底上的新型纳米酶。它们具有接近100%的金属原子利用率和均匀的活性位点，从而提高了催化活性和选择性[22][23][24][25]。迄今为止，基于SAzymes的传感器已成功用于检测与食品安全相关的多种分析物，包括农药、霉菌毒素、重金属、抗生素和抗氧化剂[26][27][28][29]。然而，合成同时具有高金属负载量和明确配位结构的SAzymes仍然是一个重大挑战，主要是因为单个金属原子在制备过程中由于表面能高而容易聚集[30]。碳氮化物（CN）是一种无金属的二维半导体，具有层状结构、丰富的表面功能、高稳定性和生物相容性，是锚定金属单原子的理想基底[31][32]。然而，基于CN的SAzymes的发展目前受到难以稳定高密度金属原子而不使其聚集的阻碍。大多数现有方法通常只能获得较低的金属负载量，从而限制了整体催化效率[33][34]。此外，尽管CN理论上适合生物偶联，但高负载量的基于CN的SAzymes在免疫磁检测病原菌中的应用仍较少探索[35][36]。因此，开发一种简化策略来制备具有超高金属负载量和可修饰表面基团的基于CN的SAzymes是非常有意义的，但同时也具有挑战性。 本文报道了一种高效的超分子自组装结合热解策略，用于制备锚定在碳氮化物上的铜单原子纳米酶（Cu-SA-CN）。所得Cu-SA-CN不仅由于密集的活性位点而表现出优异的过氧化物酶活性，还具有出色的稳定性。我们系统研究了催化机制以及pH值、温度和基底浓度等关键影响因素。此外，利用CN基底的丰富表面基团，我们成功将抗体偶联到纳米酶上作为信号探针，构建了一种用于灵敏检测鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）的夹心型免疫磁比色生物传感器（图1）。这项研究扩展了基于碳氮化物材料的生物传感应用，并为复杂食品基质中病原菌的灵敏检测开辟了新途径。

化学试剂和仪器

化学试剂和仪器的详细信息见补充材料。

单原子掺杂碳氮化物的合成

Cu-SA-CN是通过超分子自组装方法随后进行热聚合制备的[37]。通常，将0.51 g氰尿酸溶解在10 mL二甲基亚砜（DMSO）中制备溶液A，将0.50 g三聚氰胺溶解在20 mL DMSO中制备溶液B。在持续搅拌下，将溶液A逐滴加入溶液B中，然后继续搅拌10分钟。

Cu-SA-CN纳米酶的合成与表征

图1a展示了Cu-SA-CN纳米酶的制备过程，该过程结合了超分子自组装和热聚合。首先，三聚氰胺和氰尿酸在DMSO中自组装形成氢键连接的三聚氰胺-氰尿酸（MCA）超分子前体。如图1b所示，MCA前体形成大小约为2 μm的均匀绣球花状微球。微球的形成可归因于层间π-π相互作用。

结论

总之，我们利用超分子自组装和热聚合策略制备了铜单原子纳米酶。XAFS结果表明，Cu-N₃位点是主要的活性中心，赋予Cu-SA-CN优异的过氧化物酶活性。活性氧捕获实验和ESR光谱均表明Cu-SA-CN催化了H₂O₂的分解，生成多种ROS，这些ROS进一步氧化底物TMB产生比色信号。

CRediT作者贡献声明

王文：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学。 杨华：指导、资源提供、数据分析。 董晓萍：撰写 – 审稿与编辑、指导、项目管理、资金争取、概念构思。 郭丰宇：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学研究。 雷华：验证、方法学研究、数据分析。 杨倩：验证、方法学研究、概念构思。 金娜娜：验证、方法学研究、概念构思。 张新阳：验证。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了杭州市农业与社会发展领域关键研究计划（20241203A23）、中国国家重点研发计划（2017YFE0127400）、国家自然科学基金（51908491）、浙江省自然科学基金（LY20B070001）以及浙江科技学院科学基金（21062255-Y）的财政支持。