基于双(苯基硒化物)的荧光探针，可用于快速、灵敏且选择性地检测人体结肠癌细胞中的超氧阴离子

《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：Bis-(phenylselenide) based turn-on fluorescent probe for rapid, perceptible and selective detection of superoxide anion in human colon cancer cells

本工作开发了一种基于光诱导电子转移（PET）机制的荧光探针Se-BODIPY-Se，用于高选择性检测超氧阴离子。该探针在生理pH下具有31nM的超低检测限，并表现出63倍的荧光增强，同时能有效区分其他ROS和金属离子。实验证明其在HCT-116癌细胞中的成像应用潜力。

　　

Snehal S. Salunkhe | Divyesh S. Shelar | Pratik P. Dhavan | Ray J. Butcher | Sudesh T. Manjare

印度孟买大学化学系，孟买 400098

摘要

超氧阴离子是一种活性氧（ROS）类型，由氧分子的一电子还原产生。它在细胞线粒体中暂时存在，随后扩散到整个细胞中，在人体内调节许多信号转导过程。由于高水平的超氧阴离子可能对人类身体造成永久性损害，因此发现一种有效的方法对其进行选择性和敏感性的检测至关重要。本研究探讨了一种新的“开启型”荧光探针Se-BODIPY-Se，该探针通过¹H、¹³C、⁷⁷Se、¹¹B和¹⁹F核磁共振光谱、液相色谱-质谱（LCMS）以及单晶X射线衍射（XRD）进行了合成和表征。该探针的原理基于苯硒化物作为电子供体与BODIPY作为电子受体之间的光诱导电子转移（PET）机制。当与超氧阴离子反应时，硒的氧化会终止PET过程，从而使荧光恢复。该探针对超氧阴离子具有高度选择性，而对其他ROS、金属离子、生物硫醇和氨基酸则没有选择性，在518 nm处荧光强度增强了63倍。该探针在生理pH值（7.4）下工作，检测限可低至31 nM。此外，它能在HCT-116癌细胞系中选择性检测超氧阴离子，荧光强度增加了7.4倍，表明其在活细胞成像中的潜在应用。

引言

活性氧（ROS）是在完全或不完全氧化反应过程中从氧分子产生的。ROS的概念不仅限于自由基分子，如超氧阴离子（O₂^.-）、烷氧基（RO）、羟基（.OH）、过氧基（ROO）和过氧化氢（.O₂H）自由基，还包括单线态氧（¹O₂）、次氯酸盐（OCl^?）和过氧化氢（H₂O₂），这些都被认为是非自由基的活性物质。携带氧的蛋白质，如血红蛋白[1]、线粒体[2]和NADPH氧化酶[3]，是通过酶介导在哺乳动物细胞中产生ROS的。ROS是在一系列由超氧阴离子释放引发的酶促反应过程中释放的。在所有ROS中，超氧阴离子最为普遍；根据其浓度，它们决定了细胞的存活或死亡[4]。正常细胞内的ROS生成与主要的生理过程密切相关，因为它们在分子信号通路[5]、基因表达调节[6]以及许多病理过程中起着重要作用。超氧阴离子的过量积累通常是由于抗氧化防御机制受损或线粒体完整性受损所致。这反过来可能导致超氧阴离子产生点的邻近肽链降解[7]，从而引发氧化失衡状态。氧化应激引发的显著氧化损伤可能促进多种疾病的发生，尤其是帕金森病、阿尔茨海默病[8]、动脉粥样硬化[9]、癌症[10]和自闭症[11]等。由于超氧阴离子的浓度可以用作有前景的诊断指标，因此对其的精确检测对于研究和理解与氧化应激相关的健康并发症至关重要。

尽管传统方法，如高效液相色谱[12]、电子顺磁共振[13]、电化学方法[14]、质谱分析[15]等常用于超氧阴离子的检测，但这些方法的主要缺点是大多数无法检测其生成点。此外，许多方法仅适用于高浓度下的检测，而低浓度下的定量则需要更高的灵敏度。在现有的多种技术中，荧光标记框架被认为最适合检测超氧阴离子，因为它们具有较高的响应性和在生成点进行测量的潜力[16]。该技术的关键优点是能够穿透细胞结构、细胞器或目标点，以收集关于氧化状态的信息，从而评估超氧阴离子。在多种荧光团中，包括pH依赖型[17,18]，BODIPY因其显著的光物理特性而受到极大关注，例如其高的摩尔消光系数、量子产率、最低的检测限以及宽的吸收和发射光谱[19]，以及其对光降解的抵抗力[20]。

硒是一种重要的元素，是许多抗氧化酶的组成部分，既存在于无机形式也存在于有机形式中。有机硒化合物因其氧化还原行为[21]、构象灵活性[22]和细胞相容性[23]而受到认可。这些化合物在评估生物重要分析物方面发挥着重要作用，因为它们能够进行可逆的氧化还原转化。当这些化合物与氧化剂接触时，硒原子容易转化为硒氧化物或硒酮[21]。这种转化可以在氧化还原响应传感机制中有效利用，尤其是在比色或荧光开启系统中。与无机形式相比，有机硒具有更好的生物利用度、较低的毒性和细胞效应。总体而言，氧化还原活性、化学反应性和生物安全性的独特组合使有机硒化学成为开发下一代探针和治疗药物的理想平台，旨在理解和干预与氧化应激相关的疾病和氧化还原调控的细胞过程。

在这里，我们通过结合有机硒化合物的氧化还原性质与荧光探针的低检测限、快速响应和显著的斯托克斯位移，全面设计并开发了一种含有双(苯硒化物)的“关闭-开启”超氧传感器Se-BODIPY-Se。通常情况下，重原子效应会导致荧光量子产率下降，但研究表明，当在BODIPY核心的2位和6位替换卤素或硫属元素等重原子时，会促进系统间交叉（ISC）[24, 25]。基于这一原理，在6位引入一个氯原子和一个苯硒化基团，预计将进一步促进非辐射衰变途径，从而降低单取代衍生物的荧光量子产率[26, 27]。

此外，在双硒化物类似物（Se-BODIPY-Se）中，两个吡咯位置的苯硒化基团引入了更强的重原子效应[28]并增强了自旋-轨道耦合[29]，这使得荧光淬灭更为有效。这种双位点提供了两个氧化还原活性的硒中心，可以氧化为硒氧化物，对活性氧产生更明显的荧光开启响应。类似的行为也在双(苯硒化物)取代的BOPHY衍生物中得到报道[30]，其中双硒化物类似物的荧光背景更低，检测限也更低。

为了实现精确检测，我们引入了两个含硒的识别位点，作为超氧阴离子的传感器。探针与超氧阴离子反应后的“开启”荧光响应会导致颜色从粉红色变为黄色，并伴有红移的发射。此外，其在HCT-116（一种人类结直肠癌细胞系）中的实用性得到了验证，表明该探针可能是协助检测活细胞中超氧阴离子的潜在工具。

合成

BODIPY 3是按照已报道的程序合成的[26]，并在进一步使用前通过¹H核磁共振光谱（图S1）进行了表征。Se-BODIPY-Se探针（4）是通过在干乙腈中搅拌BODIPY 3（1当量）和苯硒酰氯（2.1当量）的反应混合物制备的。BODIPY 3的β和β’位置都被苯硒化基团占据。

BODIPY 3的¹H核磁共振数据显示，吡咯环的β和β’质子的峰位于δ 5.99 ppm（图S1）。

结论

总之，我们设计并合成了一种基于双(苯硒化物)的BODIPY传感器，并通过¹H、¹³C、⁷⁷Se、¹¹B和¹⁹F核磁共振光谱、质谱和单晶X射线衍射等不同结构表征技术对其进行了详细描述。在实验条件下，该探针与超氧阴离子一起在518 nm处发出强烈的绿色荧光，荧光强度增强了63倍。探针显示出“开启”荧光效果。

材料和仪器

所有化学品（三氟化硼二乙醚、三乙胺、2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌（DDQ）、三氟乙酸（TFA）、3,4-二甲氧基苯甲醛和苯硒酰氯）均从商业渠道购买，无需进一步纯化。ROS、生物硫醇、氨基酸、高氯酸盐和金属离子氯化物均来自Sigma Aldrich。光谱级DMSO用于光物理研究。所有用于柱子分析的溶剂也均来自商业渠道。

CRediT作者贡献声明

Snehal S. Salunkhe：撰写初稿、可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、概念化。 Divyesh S. Shelar：方法学设计、数据分析、概念化。 Pratik P. Dhavan：方法学设计、数据分析。 Ray J. Butcher：可视化、验证、软件应用、数据分析。 Sudesh T. Manjare：撰写修订稿、可视化、验证、监督、软件应用、资源协调、项目管理。

未引用的参考文献

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利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

Snehal S. Salunkhe感谢Chhatrapati Shahu Maharaj研究、培训和人类发展研究所（SARTHI）提供的研究奖学金（SRF）。我们还要感谢IIT Bombay的Sophisticated Analytical Instrument Facility（SAIF）提供的NMR和HRMS设施。Sudesh T. Manjare衷心感谢印度新德里的科学工程研究委员会（SERB，项目编号YSS/2014/000726）提供的财政支持。