健康与过敏性哮喘中支气管肺泡与气道黏膜T细胞的表型与克隆型差异研究

《Mucosal Immunology》：Distinct phenotypes and repertoires of bronchoalveolar and airway mucosal T cells in health and allergic asthma

本研究针对不同采样方法（支气管肺泡灌洗BAL与气道刷检）获取的肺T细胞是否存在表型与克隆型差异这一关键问题，通过单细胞RNA与T细胞受体测序技术，揭示了BAL与气道黏膜T细胞在健康对照和过敏性哮喘患者中存在显著差异：气道黏膜富集组织驻留记忆T细胞（TRM）和哮喘相关的TH2细胞，而BAL T细胞则表现出更强的干扰素特征。该发现对肺部免疫学研究中采样方法的选择具有重要指导意义。

　　

肺部作为呼吸门户，持续暴露于病原体和过敏原等多种刺激之下。T细胞在抵御呼吸道感染中扮演核心角色，但其应答失调也可能导致免疫病理损伤，例如在过敏性哮喘中，针对气传过敏原的不适当2型辅助T细胞（T_H2细胞）反应会引发过敏性炎症。深入研究肺部保护性与致病性T细胞反应的生物学特性，对于改善呼吸健康至关重要。

以往研究通常通过支气管肺泡灌洗、支气管刷检或活检来获取肺组织T细胞。然而，位于支气管肺泡腔和气道黏膜的T细胞处于不同的微环境中，这些不同采样方法所获取的T细胞是否具有不同的表型和T细胞受体克隆型，此前并不明确。尤其是一些流式细胞术研究关于BAL和气道黏膜T细胞的组织驻留记忆T细胞标志物表达是否相似的结果存在矛盾，这可能与组织消化过程改变了细胞表面蛋白有关。明确BAL和气道黏膜T细胞可能存在的差异性细胞特征，对于人类肺部T细胞生物学研究至关重要。

为了回答这些问题，由Rod A. Rahimi、Neal P. Smith等人组成的研究团队在《Mucosal Immunology》上发表了一项研究。研究人员招募了3名健康对照和4名过敏性哮喘患者，通过支气管镜检查同步获取配对的BAL和支气管刷检样本。他们选择刷检而非活检来获取气道黏膜T细胞，是为了避免酶消化组织可能对T细胞表面蛋白和转录特征造成的影响。随后，研究团队分选了CD3⁺T细胞，并利用10X Genomics平台进行了单细胞RNA测序和T细胞受体测序。

主要关键技术方法

研究团队对来自3名健康对照和4名过敏性哮喘患者的13个样本（6个BAL，7个刷检）进行了单细胞RNA测序分析。通过数据整合和无监督聚类分析，鉴定了14个T细胞亚群，并进一步对CD8 T细胞和CD4 T细胞进行了亚群细分。利用基因集富集分析比较了不同样本间T细胞表型差异，并通过T细胞受体测序分析了T细胞克隆的分布和多样性。此外，还整合了公共数据库中的单细胞RNA测序数据作为独立验证队列。

组织驻留T_H2细胞在过敏性哮喘患者气道黏膜中高度富集，但在BAL中未见此现象

研究人员首先比较了所有受试者中BAL与刷检样本的T细胞亚群相对丰度。结果显示，BAL样本中富含CD4 T细胞，而刷检样本中富含CD8 T细胞。在CD4 T细胞亚群中，研究人员鉴定出了T_H1细胞、淋巴归巢细胞、T_H17样细胞、调节性T细胞和T_H2细胞。当比较过敏性哮喘患者与健康对照时，在BAL样本中，CD4 T细胞仅有微小差异。然而，在刷检样本中，过敏性哮喘患者的T_H2细胞出现了显著富集，其比值比高达20.8。这一效应在BAL样本中并未观察到。这表明气道黏膜为过敏性哮喘中的T_H2细胞维持提供了一个独特的细胞微环境。

气道黏膜T细胞表现出富集的组织驻留记忆特征，而BAL T细胞表现出富集的干扰素特征

研究人员进一步全面检测了已知在组织驻留记忆T细胞中高表达的标志基因。与BAL T细胞相比，刷检样本中的CD8和CD4 T细胞亚群均表现出更高的组织驻留记忆T细胞标志物表达，其中整合素ITGAE和CD69的表达在健康对照和过敏性哮喘患者中均较高。相反，BAL T细胞 across most populations exhibited markedly higher expression of interferon genes compared to brush T cells。基因集富集分析确认了I型干扰素通路与BAL中的CD4和CD8 T细胞强烈相关。为了验证这些发现，研究人员整合分析了公共数据库中的单细胞RNA测序数据，独立验证队列的分析结果与初始队列高度一致：刷检T细胞高表达组织驻留记忆T细胞标志基因，而BAL T细胞高表达干扰素特征基因。

T细胞克隆在气道黏膜中富集

鉴于表型差异，研究人员进一步分析了T细胞受体克隆型。希尔多样性指数分析显示，BAL样本的T细胞受体库多样性显著高于刷检样本。比较扩增的T细胞受体克隆的相对比例发现，有43个克隆在刷检库中增加，其中40个是CD8 T细胞克隆。有趣的是，克隆在刷检相对于BAL中的相对丰度与组织驻留记忆T细胞标志物ITGAE、CD69、ITGA1和CXCR6的表达呈强正相关。这表明气道黏膜富集了具有独特T细胞受体特异性的组织驻留记忆T细胞。

研究结论与意义

本研究通过比较健康对照和过敏性哮喘患者中BAL与支气管刷检T细胞的转录和克隆特征，得出了几项重要发现。首先，支气管刷检样本而非BAL样本，在过敏性哮喘中富集了T_H2细胞，这解释了先前研究为何未能通过BAL来源的免疫细胞发现过敏性哮喘中T_H2细胞的富集。其次，刷检获取的T细胞高表达组织驻留记忆T细胞标志物，而BAL T细胞则表现出更显著的干扰素特征，这种差异更可能源于支气管肺泡腔内的环境信号，而非采样方法本身的人工假象。第三，BAL和刷检T细胞的T细胞受体库截然不同，BAL T细胞多样性更高，而某些克隆型在刷检样本中显著富集。这些在气道黏膜中富集的T细胞克隆可能在对呼吸道病原体产生快速、强大的抗原特异性应答中发挥关键作用。

本研究阐明了人类肺部不同区域T细胞的重要区别性特征，对未来在健康和不同疾病状态下研究人类肺部T细胞具有重要启示。研究结果支持了小鼠模型中的数据，即气道为支持组织驻留记忆T细胞提供了微环境。此外，本研究采用两次支气管刷检后通过细胞分选富集CD3⁺T细胞的技术方法，为获取足够数量的气道黏膜T细胞进行下游分析提供了一条可行路径，同时避免了组织消化可能带来的影响。