醉鱼草苷通过单细胞转录组学调控肝内免疫微环境缓解脓毒症急性肝损伤的机制研究

《Frontiers in Immunology》：Single-cell transcriptional profiling revealed the protective effects of Buddleoside in sepsis-associated acute liver injury

本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，系统揭示醉鱼草苷（Buddleoside, Bud）通过抑制内皮细胞（ECs）活化、调控Ccl4+Cxcl1+中性粒细胞（Neu）炎症表型、重塑巨噬细胞（M?）亚群功能，并阻断CXCL2-CXCR2信号轴，从而缓解脓毒症相关急性肝损伤（SALI）的免疫调控新机制。

　　

醉鱼草苷缓解脓毒症急性肝损伤的免疫机制研究

引言

脓毒症作为重症监护病房患者死亡的主要原因，是由感染引发免疫反应失调导致的全身炎症反应综合征。脓毒症相关急性肝损伤（SALI）是其严重并发症之一，其特征包括微循环功能障碍导致的缺氧性肝炎、过度炎症引起的肝细胞坏死以及胆汁代谢紊乱导致的胆汁淤积。醉鱼草苷（Buddleoside, Bud）是一种来源于菊科植物的黄酮类化合物，因其抗炎、抗氧化和免疫调节作用而在肝脏疾病中展现出治疗潜力。本研究旨在通过单细胞转录组学（scRNA-seq）技术，系统评估Bud对SALI的保护作用并深入探索其免疫调节机制。

材料与方法

研究采用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，通过盲肠结扎穿刺（CLP）模型诱导SALI。动物实验分为对照组、模型组、Bud低中高剂量组（15、30、60 mg/kg）以及阳性对照药物水飞蓟宾组。在CLP手术后24小时收集血清和肝组织样本，进行生化检测、组织病理学分析和scRNA-seq。单细胞悬浮液通过MobiNova-100平台进行测序，使用Seurat R包进行标准化和聚类分析，UMAP算法进行降维可视化，并通过GSVA计算炎症反应和细胞因子评分。细胞间通讯网络通过CellChat工具分析。

结果

Bud显著减轻CLP诱导的SALI

生化分析显示，模型组血清ALT和AST水平显著升高，而中高剂量Bud和水飞蓟宾治疗有效逆转了这一变化。H&E染色显示Bud治疗改善了肝小叶结构紊乱，减轻了肝细胞肿胀变性和炎症细胞浸润，表明Bud通过减少肝细胞损伤和抑制炎症反应缓解SALI。

scRNA-seq揭示肝内细胞亚群异质性及其对Bud的响应

UMAP分析鉴定了38个细胞亚群，包括嗜碱性粒细胞、B细胞、浆细胞、T细胞、中性粒细胞、库普弗细胞（KCs）、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞（DCs）、单核细胞、内皮细胞（ECs）、上皮细胞和成纤维细胞。Bud给药显著改变了肝微环境中关键细胞类型的比例，其中ECs、巨噬细胞和中性粒细胞的变化最为明显。

Bud调节ECs异质性和功能转录谱

多重免疫荧光（mIF）证实了CD31阳性ECs的原位定位。scRNA-seq分析将ECs分为11个亚群，伪时间轨迹分析显示Cxcl10⁺Egr1⁺Endo亚群可能代表EC分化的起源。功能热图显示Cox8a⁺Endo、Ccl2⁺Cxcl1⁺Endo和Zfp36⁺Atf3⁺Endo亚群表现出明显的炎症特征，并富集凋亡相关基因。Bud处理后，Cox8a⁺Endo和Ccl2⁺Cxcl1⁺Endo亚群比例显著降低。差异表达基因分析显示，Bud下调了这些亚群中Selp的表达，同时上调了Selenop和Dnase1l3。Selp参与白细胞滚动和粘附，其下调表明Bud抑制了EC活化；Selenop具有抗氧化作用；Dnase1l3参与降解中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），表明Bud通过多途径调节EC功能，维持肝微环境稳态。

Bud抑制Ccl4⁺Cxcl1⁺Neu亚群的炎症状态以减轻SALI

mIF证实了CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞的原位存在。scRNA-seq将中性粒细胞分为7个亚群，其中Ccl4⁺Cxcl1⁺Neu亚群表现出最高的炎症评分。Reactome富集分析显示该亚群基因显著富集于中性粒细胞脱颗粒、细胞应激反应、细胞因子信号传导等炎症相关通路。Bud给药显著抑制了Ccl4⁺Cxcl1⁺Neu亚群的炎症活性，并下调了S100a9和中性粒细胞颗粒蛋白（Ngp）的表达。S100a9促进中性粒细胞脱颗粒和NET形成，Ngp下调与细胞毒性酶释放减少相关，表明Bud通过抑制该亚群的炎症功能缓解SALI。

Bud调控巨噬细胞亚群异质性以抑制肝损伤

mIF证实了CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞的原位定位。scRNA-seq鉴定了6个巨噬细胞亚群：M01（Marco⁺Clec4f⁺Cd163⁺KCs）为肝驻留巨噬细胞；M03（Arg1⁺Cd74⁺H2-Ab1⁺M?）富集M2样标志物；M04（Vcan⁺Spp1⁺Chil3⁺M?）上调M1样标志物；M05（Cxcl13⁺Apoc1⁺M?）和M06（Ccl3⁺Cxcl2⁺F10⁺M?）表达细胞因子相关基因。伪时间轨迹分析将亚群分为三个分化状态。GSVA显示Marco⁺Clec4f⁺Cd163⁺KCs和Ccl3⁺Cxcl2⁺F10⁺M?亚群具有较高的细胞因子评分，而Cxcl13⁺Apoc1⁺M?亚群的炎症评分最低。Bud处理后，Marco⁺Clec4f⁺Cd163⁺KCs亚群的细胞因子评分以及Itga4⁺Slc8a1⁺M?、Arg1⁺Cd74⁺H2-Ab1⁺M?、Vcan⁺Spp1⁺Chil3⁺M?和Ccl3⁺Cxcl2⁺F10⁺M?亚群的炎症评分显著降低，表明Bud通过抑制特定巨噬细胞亚群的细胞因子分泌和炎症活化发挥保护作用。

Bud抑制ECs与中性粒细胞间的CXCL2-CXCR2信号转导

细胞通讯分析显示，Bud组细胞间相互作用总数和相互作用权重均高于CLP组，但ECs与其他细胞间的相互作用普遍减少。特别值得注意的是，Bud处理后ECs与中性粒细胞之间的CXCL2-CXCR2信号轴显著下调。CXCR2是中性粒细胞招募的关键受体，该信号轴的下调可能是Bud抑制中性粒细胞招募的重要机制。

讨论

本研究通过scRNA-seq深入揭示了Bud缓解SALI的免疫调控新机制。与之前研究的可溶性环氧化物水解酶（sEH）抑制剂TPPU主要促进抗炎巨噬细胞和中性粒细胞不同，Bud独特地靶向并抑制促炎性Ccl4⁺Cxcl1⁺中性粒细胞亚群。Bud通过调节肝窦内皮细胞（LSECs）的组成和功能，抑制Selp表达减少白细胞招募，上调Selenop缓解氧化应激，增强Dnase1l3以促进NETs清除。同时，Bud抑制巨噬细胞亚群的炎症活性和细胞因子分泌，并阻断ECs与中性粒细胞之间的CXCL2-CXCR2 chemokine信号轴，从而多维度缓解肝损伤。研究的局限性包括观察时间较短、分子机制细节需进一步功能验证以及临床转化面临挑战。

结论

本研究阐明了醉鱼草苷通过调控肝内内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多个关键细胞群体的功能和相互作用，有效缓解脓毒症急性肝损伤的免疫机制，为开发基于天然产物的免疫治疗策略提供了重要的理论依据。