《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Glutathione peroxidase 4 as an emerging therapeutic target in osteoarthritis: focus on ferroptosis
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这篇综述系统阐述了铁死亡（ferroptosis）在骨关节炎（Osteoarthritis, OA）发病机制中的核心作用，并重点探讨了其关键抑制因子——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）作为新兴治疗靶点的潜力。文章详细分析了GPX4在软骨细胞中的表达变化、其上游（如System Xc?-GSH轴、Nrf2通路）与下游（如抑制脂质过氧化、维持线粒体完整性、减少ECM降解酶诱导）分子调控网络，并总结了靶向GPX4的治疗策略（如药物、基因疗法、联合治疗）及当前挑战与未来方向。
引言
骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种全球范围内极为普遍的退行性关节疾病，其主要临床表现为关节疼痛、僵硬和活动受限。病理特征包括关节软骨退行性变、软骨下骨结构改变、滑膜低度慢性炎症和整体关节功能障碍。OA的发病机制高度复杂，涉及异常机械负荷、年龄相关代谢变化、持续炎症反应、细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）代谢失调以及遗传易感性等多种因素的相互作用。目前，临床上的物理治疗、镇痛药物乃至关节置换手术虽可缓解症状，但尚无药物能有效阻止或逆转软骨退变。因此，探索OA发生发展的新型分子机制并确定可行的干预靶点具有重要的科学和临床意义。
近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，在OA发病机制研究中受到广泛关注。谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）是终止脂质过氧化、抑制铁死亡的核心酶。其在病理条件下OA软骨中的表达和活性发生改变，表明GPX4在OA发病机制和治疗中起着关键作用。
GPX4与铁死亡在OA中的作用
铁死亡的定义、生物学特征及其与其他细胞死亡形式的区别
铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡，主要由脂质过氧化物的异常积累触发。其在生化途径、形态学变化和遗传调控水平上与凋亡、坏死性凋亡、自噬和坏死等经典细胞死亡形式存在根本区别。铁死亡的生物学特征主要体现在几个关键方面：首先，其发生严格依赖于细胞内铁，铁通过催化Fenton反应高效促进活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的生成，直接驱动细胞膜中多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）的过氧化。其次，铁死亡的执行核心涉及膜脂中含多不饱和脂肪酸的磷脂（PUFA-containing Phospholipids, PUFA-PLs）的过氧化，导致大量细胞毒性脂质过氧化衍生物（如特异性脂质氢过氧化物和4-羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal, 4-HNE）等活性醛类）积累，最终对质膜完整性造成不可逆损伤。形态上，铁死亡细胞最典型的变化集中在线粒体，表现为线粒体体积显著减小、膜密度增加、嵴减少或消失，而细胞核相对完整，缺乏染色质凝集或核膜破裂等凋亡特征。此外，铁死亡过程可被特定小分子精确调控，例如erastin可通过抑制系统Xc?（System Xc?）活性、耗竭细胞内还原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）来诱导铁死亡，而RSL3则直接共价结合并抑制GPX4活性。相反，自由基捕获抗氧化剂如ferrostatin-1（Fer-1）和liproxstatin-1（Lip-1）能有效中和脂质过氧自由基，阻断链式反应，特异性抑制铁死亡。
GPX4在铁死亡中的核心作用
GPX4是一种硒半胱氨酸依赖的抗氧化酶，在细胞防御铁死亡的网络中占据不可替代的中心地位。其核心生化功能是利用还原型GSH作为必需辅因子，特异性催化膜磷脂内的脂质氢过氧化物还原为相应的无害脂醇。该反应直接中断脂质过氧化的传播链，从而在分子水平上阻止铁死亡的执行。GPX4的作用机制具有高度底物特异性，能直接消除位于细胞器和细胞膜上最具破坏性的脂质过氧化产物，从源头上保障膜的稳定性和功能。GPX4酶活性严格依赖于细胞内持续充足的GSH供应。而GSH的合成又受到胱氨酸/谷氨酸逆向转运体系统Xc?的严格调控，该系统核心亚基是溶质载体家族7成员11（Solute Carrier Family 7 Member 11, SLC7A11）。因此，System Xc?–GSH–GPX4轴构成了一条完整且精细调控的抗氧化防御链。关键研究的遗传学证据证实，在各种细胞类型中通过基因敲除消除GPX4表达，或使用如RSL3等小分子抑制剂直接靶向其活性位点，均能一致且高效地诱导典型的铁死亡。在整体动物水平，全身性或组织特异性敲除GPX4会导致急性器官衰竭和动物死亡。这些强有力的体外和体内证据共同确立了GPX4在维持机体氧化还原稳态和防御铁死亡中不可或缺的生理保护作用。尽管GPX4是抑制铁死亡的主要分子，但近期研究也揭示了细胞内其他平行的补偿性防御机制，例如质膜定位的铁死亡抑制蛋白1（Ferroptosis Suppressor Protein 1, FSP1）通过介导辅酶Q10（Coenzyme Q10, CoQ10）的再生发挥抗氧化功能，线粒体内的二氢乳清酸脱氢酶（Dihydroorotate Dehydrogenase, DHODH）被认为有助于维持该细胞器的氧化还原平衡。这些平行通路的存在表明细胞抗铁死亡的机制具有多层次和互补性。然而，在大多数生理和病理背景下，GPX4仍被广泛认为是该防御网络中最主要和最核心的效应分子。
OA中铁死亡的实验证据
近年来，随着对铁死亡认识的深入，大量基础和临床前研究积累了支持其在OA病理中活跃作用的令人信服的证据。在关节微环境层面，对OA患者滑液和软骨组织样本的分析以及手术诱导（如DMM模型）或化学诱导的动物OA模型的研究，一致观察到明显的铁代谢异常和病变关节局部显著的铁积聚。在核心防御分子表达方面，多个独立研究团队一致报道，在OA患者软骨组织、模拟OA炎症环境（如用白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）处理）的体外软骨细胞或直接铁过载条件下，GPX4的蛋白和mRNA水平显著下调，并伴有细胞内GSH水平的耗竭。相反，脂质过氧化标志物如丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和4-HNE则显著增加。在功能干预和治疗验证层面，多项动物研究提供了最直接的证据：关节腔内注射或全身给予特异性铁死亡抑制剂（如Fer-1），或通过药物（如使用天然产物）或基因（如使用过表达载体）上调GPX4表达、激活SLC7A11或关键转录因子Nrf2，均能在不同程度上恢复OA动物模型的软骨形态、减少软骨细胞死亡并显著降低ECM降解标志物的表达水平。关于机制联系与整合，研究进一步揭示，两种最常见的OA致病刺激——慢性炎症细胞因子（如IL-1β）和异常机械应力——都能有效诱导软骨细胞铁死亡。尤其值得注意的是，机械过负荷可通过激活机械敏感离子通道Piezo1，介导钙内流，继而触发下游GPX4调控的铁死亡通路，这在OA经典的机械致病因素与新兴的氧化应激介导的细胞死亡途径之间建立了直接而重要的机制桥梁。
GPX4下调与OA严重程度的相关性
广泛的临床病理分析和严格控制的动物模型研究共同揭示了一个明确的模式：GPX4的蛋白表达水平或生物活性通常与OA病变严重程度呈显著负相关。在人体标本和通过手术（如DMM模型或ACLT）建立的OA模型中，OA软骨和滑膜组织的免疫组化或蛋白质印迹分析显示，病变区域的GPX4表达显著低于邻近相对正常组织或正常对照。这种下调程度与软骨退变严重程度呈正相关，在以表面纤维化和严重蛋白聚糖丢失为特征的晚期病变中最为明显。相反，通过转基因技术软骨特异性过表达GPX4，或使用小分子药物（如某些天然化合物或铁死亡抑制剂）恢复其活性，可显著延迟模型动物的软骨退变、改善软骨下骨硬化和骨赘形成、减轻滑膜炎。除了受Nrf2等因子转录调控外，GPX4蛋白丰度和稳定性还受到复杂的翻译后修饰和蛋白质相互作用网络的精细调控。例如，近期研究表明GPX4稳定性受泛素-蛋白酶体途径调控，其蛋白可能被特定的E3泛素连接酶识别并降解。p21等分子被报道可直接与GPX4相互作用，竞争性或变构地影响其泛素化速率，从而稳定GPX4，增强细胞在氧化应激下的抵抗力。这些发现为解释OA在不同疾病阶段、受累关节和个体中观察到的异质性和差异进展提供了新的分子基础。
OA中GPX4的分子机制
GPX4的上游调控：System Xc?–GSH轴与Nrf2通路
System Xc?是由催化亚基SLC7A11和调节亚基SLC3A2通过二硫键连接的异二聚体膜转运蛋白，其功能是跨膜进行胱氨酸/谷氨酸交换。这种转运活性对于维持细胞内还原型GSH的合成至关重要，因为摄入的胱氨酸是GSH合成的限速前体。GSH作为GPX4酶促反应中不可或缺的电子供体，直接决定了GPX4还原脂质过氧化物的酶活性。因此，任何抑制SLC7A11功能或下调其表达的因素都会导致细胞内GSH耗竭，从而使GPX4缺乏必需底物，最终引发不可逆的铁死亡。在OA的病理环境中，各种致病刺激已被证实会显著损害System Xc?功能。例如，炎症细胞因子（如IL-1β和TNF-α）的持续刺激、持续性氧化应激以及病理性铁过载状态均被证明可显著抑制SLC7A11的表达或其转运活性。这种抑制使得GPX4因缺乏所需共底物GSH而无法发挥其保护功能，导致软骨细胞更易发生铁死亡。
核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）是细胞氧化应激反应的主要转录调节因子。在生理条件下，Nrf2与其胞质抑制剂Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1）结合而处于失活状态。当细胞受到亲电试剂或ROS挑战时，Nrf2被激活并转位入核，启动一系列含有抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element, ARE）的靶基因转录。这些靶基因包括多种抗氧化酶和GSH合成相关基因，其中包括System Xc?的关键组分SLC7A11。激活Nrf2可直接或间接转录上调GPX4表达，并协同诱导其他抗氧化分子，形成针对脂质过氧化的全面防御网络。在OA研究中，近期证据表明，使用具有生物活性的天然产物或合成小分子激动剂药理激活Nrf2–GPX4信号轴，可有效减轻体外培养的软骨细胞和体内OA动物模型的铁死亡，同时显著抑制ECM降解进程。
GPX4的翻译后修饰与蛋白稳定性
GPX4的蛋白丰度和功能活性不仅由转录水平决定，还受到一系列复杂的转录后和翻译后修饰事件的精细调控，包括但不限于泛素化、与特定蛋白质的相互作用以及潜在的磷酸化和糖基化。近期研究发现，细胞周期蛋白p21可通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用影响GPX4稳定性。在氧化应激下，这种相互作用有助于维持GPX4蛋白水平，从而发挥细胞保护作用。功能实验证实，在DMM手术诱导的小鼠OA模型中敲低p21表达会加剧关节软骨降解，并伴有体内GPX4蛋白水平的显著降低，证明p21通过调节GPX4稳定性在OA进展中发挥重要的抗铁死亡作用。此外，在OA相关的炎症和代谢应激环境下，细胞可能通过诱导特定E3泛素连接酶活性，促进GPX4泛素化及随后的蛋白酶体降解，从而增加细胞对铁死亡的易感性。
GPX4的下游效应
GPX4最直接和核心的下游生物学效应在于其能够特异性催化细胞器和细胞膜上的脂质过氧化物还原为无害的脂醇。这一生化反应直接阻止了生物膜结构的破裂和毒性脂质衍生信号分子的异常积累，从而有力地维持了质膜和线粒体膜的结构完整性和正常生理功能。线粒体作为细胞的动力源和关键信号枢纽，其膜脂质过氧化会带来严重后果，包括能量代谢的严重破坏以及通过放大凋亡或其他死亡信号通路而决定性改变细胞命运。GPX4的存在及正常功能可在分子水平有效阻断由脂质过氧化引发的这一恶性循环，是在OA病理应激下维持软骨细胞存活的关键因素。
脂质过氧化过程中产生的活性醛类（如4-HNE和MDA）等次级产物不仅是细胞损伤的标志，也是有效的生物信号分子。这些物质可激活核因子κB（Nuclear Factor kappa B, NF-κB）等关键促炎信号通路，从而诱导基质金属蛋白酶13（Matrix Metalloproteinase 13, MMP13）和含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5（A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs 5, ADAMTS5）等ECM降解酶的基因转录和蛋白分泌。这些酶的上调直接导致软骨中核心ECM成分（如Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖）的过度分解。GPX4通过其上游抑制脂质过氧化的作用，可间接但有效地降低这些破坏性酶的表达水平，从而延缓或阻止ECM分解。动物模型研究一致表明，药理抑制铁死亡或基因上调GPX4表达会导致软骨组织中MMP和ADAMTS表达显著降低，并伴有软骨结构完整性的明显改善。
GPX4和铁死亡对OA病理的贡献远不止于直接保护软骨细胞。它们还通过调节脂质过氧化产物和死亡细胞释放的碎片等信号，深刻影响关节内其他细胞的行为，特别是成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-Like Synoviocytes, FLS）和浸润的巨噬细胞等免疫细胞的活化状态，从而参与关节腔内低度慢性炎症的放大和持续。具体而言，4-HNE等脂质过氧化产物可作为内源性危险信号，激活NF-κB通路和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3）炎症小体，随后触发IL-1β和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）等强效炎症细胞因子的释放。这些细胞因子不仅直接损伤软骨细胞，还会反馈作用于滑膜和其他软骨细胞，沿着“软骨-滑膜”轴形成自我放大的炎症恶性循环，驱动更多软骨细胞陷入氧化损伤和铁死亡，从而加剧OA的整体病理进展。
GPX4与ACSL4、LPCAT3等的协同相互作用
铁死亡的发生强烈依赖于其特异性底物——膜磷脂内的PUFAs的存在。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（Acyl-CoA Synthetase Long-Chain Family Member 4, ACSL4）是脂质代谢中的关键酶，负责催化游离PUFAs与辅酶A的结合。活化后的酰基辅酶A可被整合入膜磷脂中。因此，ACSL4是决定膜磷脂中可氧化PUFAs含量的关键促进因子，从而促进铁死亡。在OA研究中，多项独立研究发现ACSL4在退变软骨组织中表达上调。其表达增加显著提高了细胞膜中可氧化脂质底物的库容，从而全面增加软骨细胞对铁死亡的易感性。相反，通过药物、特异性长链非编码RNA（Long Non-Coding RNA, lncRNA）或其他干预手段抑制ACSL4的表达或活性，已被证明能有效降低脂质过氧化水平并对软骨细胞发挥保护作用。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（Lysophosphatidylcholine Acyltransferase 3, LPCAT3）与ACSL4协同作用，负责将ACSL4活化的PUFA-CoA掺入膜磷脂，完成膜重塑。因此，协调调控ACSL4和LPCAT3等脂质代谢酶的表达和活性，被认为是从减少铁死亡底物来源角度进行干预的重要策略。
平行防御通路：GPX4、DHODH与FSP1
尽管GPX4–GSH轴被广泛认为是抵抗质膜脂质过氧化和铁死亡的主要防线，但近期的发现揭示了细胞内不依赖于GPX4的平行防御机制，展现了细胞抗氧化网络的复杂性和冗余性。这些平行机制主要包括线粒体DHODH和质膜定位的FSP1–CoQ10系统。DHODH是嘧啶核苷酸从头合成途径中的关键酶，位于线粒体内膜。除了其经典的代谢功能外，研究发现DHODH可通过维持其自身的线粒体CoQ/CoQH2氧化还原池来限制线粒体内的脂质过氧化，从而独立地抑制铁死亡。另一方面，FSP1最初被认为是一种促凋亡因子，现已被新确立为一种有效的抗铁死亡蛋白。FSP1定位于质膜，利用NAD(P)H将CoQ10还原为CoQ10H2（泛醇），后者作为一种亲脂性自由基捕获抗氧化剂，可有效中断脂质过氧化链式反应，从而在质膜上建立了一条独立于GPX4–GSH系统的防线。这些重要发现表明，在GPX4功能不足或受抑制的病理条件下，通过药理学或遗传学手段增强DHODH或FSP1活性，具有作为有效替代或补偿治疗策略的潜力。
靶向GPX4治疗OA的策略
