《Journal of Chromatography B》：Simple ion-pairing reversed phase LC-UV method for the relative quantification of capping species in mRNA-based modalities
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本文开发了一种适用于质量控制（QC）实验室的简单、稳健的离子对反相液相色谱-紫外检测（IP-RPLC-UV）方法，用于相对定量mRNA治疗剂和疫苗中的关键5′端加帽物种（如未加帽、Cap 0、Cap 1、Cap G转录本及非模板添加+G）。该方法采用寡核苷酸杂交和RNase H消化策略靶向切割5′端，可在20分钟内实现加帽物种的基线分离。通过系统筛选离子对试剂并利用实验设计（DoE）优化参数，最终确定丁基乙酸铵（BAA）为最佳选择，方法表现出良好的灵敏度（未加帽物种定量限为0.01 mg/mL）和重复性。此研究为首个针对加帽结构常规相对定制的IP-RPLC-UV方法，为基于质谱（MS）的工作流程提供了实用的替代方案，有助于推动mRNA药物开发中可及、可靠的分析控制策略的实施。
信使RNA（mRNA）为基础的疗法和疫苗已成为现代生物制药研发的前沿，为疫苗、蛋白替代疗法和基因编辑提供了多功能平台。然而，mRNA分子的有效性和安全性高度依赖于其5′端“帽子”结构的完整性。这个特殊的结构——一个通过5′–5′三磷酸桥连接到mRNA转录本5′末端的修饰鸟苷核苷酸——如同一个重要的分子“身份证”，它不仅能保护转录本免受外切核酸酶的降解，还是真核翻译起始因子复合物（eIF4F）的识别标志，对于核糖体招募和高效蛋白质合成至关重要。在mRNA药物中，正确的加帽不可或缺：未加帽或加帽不当的转录本会被细胞核酸酶快速降解，引发不必要的先天免疫反应，并导致蛋白质表达水平低下。
目前，评估加帽情况的现有分析方法通常依赖于质谱（MS）和氟化溶剂，这些方法成本高昂、技术要求高，并不总是适合常规的质量控制（QC）实验室。质谱仪器的复杂性、对操作人员的专业要求以及维持其稳定运行的成本，使得许多QC实验室难以常规开展基于MS的加帽分析。此外，常用的离子对试剂如六氟异丙醇（HFIP）虽能提升MS灵敏度，但其本身也存在环境和安全考量。因此，开发一种不依赖MS、无需HFIP、简单、稳健且适用于QC实验室日常分析的加帽物种定量方法，对于加速mRNA药物的研发和质量控制具有迫切的需求和重要意义。这项研究旨在填补这一空白，相关成果发表在《Journal of Chromatography B》上。
为开展此项研究，作者主要应用了几个关键技术方法：1. 样本制备与靶向切割：利用设计的DNA/RNA嵌合寡核苷酸与mRNA的5′端非翻译区（5′-UTR）杂交，随后使用核糖核酸酶H（RNase H）进行特异性切割，释放出包含加帽结构的短核苷酸片段（约5个核苷酸），以便后续色谱分析。研究样本由赛诺菲mRNA卓越中心提供，涵盖了具有显著加帽差异的mRNA物种。2. 色谱方法开发与优化：建立了离子对反相液相色谱结合紫外检测（IP-RPLC-UV）的分析平台。核心步骤包括系统筛选了多种离子对试剂（如三乙基乙酸铵TEAA、二异丙基乙基乙酸铵DIPEAA、丁基乙酸铵BAA、己基乙酸铵HAA），并采用实验设计（DoE）系统考察了注射体积、离子对试剂浓度、流动相pH值、柱温等关键参数对分离效果（如分辨率、信噪比）和定量准确性的影响，以确定最优色谱条件。3. 方法学验证与比较：对建立的IP-RPLC-UV方法进行了初步的方法学考察，包括测定未加帽物种的定量下限（LLOQ），评估方法的重现性和中间精密度，并通过与参考方法（UHPLC-MS法）分析实际样品的结果进行比对，验证所开发方法的准确性和可靠性。
3.1. 加帽物种和寡核苷酸杂交设计
研究人员首先通过寡核苷酸杂交和RNase H消化来特异性切割mRNA的5′端，从而得到需要分析的短片段。他们预期会得到四种主要的加帽物种：未加帽（Uncapped）、Cap 0（含7-甲基鸟苷m7G）、Cap G（仅含鸟苷G）和Cap 1（在Cap 0基础上，第一个核苷酸的核糖2′-位点还有-O-甲基化）。实验发现，除了这四种主要物种，还会产生因RNA聚合酶非模板添加导致的+G变体。
3.2. 选择最合适的离子对试剂
色谱分析的关键在于选择合适的离子对试剂（IPR），以实现不同加帽物种的充分保留和分离。研究发现，常用的TEAA对小的加帽片段保留不足，而疏水性过强的HAA（己基乙酸铵）虽能保留所有物种，但无法区分仅差一个甲基的Cap 0和Cap 1。相比之下，中等疏水性的离子对试剂表现出优势。DIPEAA（二异丙基乙基乙酸铵）能分离Cap 0和Cap 1，但引起显著基线漂移。最终，丁基乙酸铵（BAA）被确定为最佳选择，它在提供足够保留的同时，能实现所有主要加帽物种的清晰分离，且基线稳定。研究还发现，使用更大体积（380 μL）的混合腔能显著改善保留时间的重现性。
3.3. 色谱条件的优化
为了在分离主要物种的同时，也能基线分离其+G变体，并最大化灵敏度，研究人员对色谱条件进行了优化。他们首先建立了复杂的多步梯度程序。随后，通过实验设计（DoE）系统评估了注射体积、BAA浓度和流动相pH值三个因素对关键响应指标（如Cap 1相对百分比、信噪比、特定峰之间的分辨率）的影响。结果表明，pH值是影响分辨率的关键因素，pH=7时能在不同分辨率间取得最佳平衡。最终确定的最优条件为：注射体积9 μL，pH=7，BAA浓度125 mM，柱温80 °C。在此条件下，所有主要加帽物种及其+G变体均能得到清晰分离。
3.4. 方法稳健性评估
为了评估方法在实际使用中对微小参数波动的耐受性，研究人员进行了补充的析因实验设计（DoE），考察了柱温、注射体积、BAA浓度、流动相B中乙腈百分比和pH值五个参数在小范围内波动对Cap 1相对百分比的影响。结果显示，虽然这些因素在统计上有显著效应，但其导致的变异非常小（标准偏差仅0.8%），远低于有实际意义的阈值，表明该方法在预设的参数范围内具有很好的稳健性，适合常规QC应用。
3.5. 方法的确认
由于难以获得已知加帽比例的标准品，研究人员对方法进行了全面的性能确认。他们测定出未加帽物种的定量下限（LLOQ）为0.01 mg/mL。通过比较UV和MS检测的信号响应，确定无需对各物种使用特定的响应因子进行校正。方法的重现性（RSD为0.2%）和中间精密度（RSD为0.4%）良好。线性评估显示在0%至100%设计空间（DS）范围内线性良好（r2=0.999）。在0%、50%和100% DS水平的加标回收率结果也令人满意。
3.6. 应用于实际样品
最后，将建立的IP-RPLC-UV方法应用于6个具有不同加帽比例的实际mRNA样品，并将结果与UHPLC-MS参考方法进行比较。结果显示，对于Cap 1和未加帽物种，两种方法的结果高度一致（R2 > 0.99）。对于Cap G物种，虽然也存在强相关性（R2=0.81），但在其含量接近检测限的样品中，两种方法的结果偏差稍大。Bland-Altman分析显示，两种方法对Cap 1、未加帽和Cap G物种的测定结果平均偏差很小，在常规QC监控的可接受范围内。
本研究成功建立了一种稳健且适用于质量控制的IP-RPLC-UV方法，用于相对定量mRNA药物中的加帽物种。该方法通过整合寡核苷酸杂交和RNase H消化实现5′端加帽物种的特异性释放，并系统筛选出丁基乙酸铵（BAA）作为最优离子对试剂，在避免使用质谱和六氟异丙醇（HFIP）的前提下，实现了包括未加帽、Cap 0、Cap 1、Cap G及其+G非模板添加物在内的多种加帽物种的基线分离。经过实验设计（DoE）优化和验证，方法表现出高灵敏度（未加帽物种LLOQ为0.01 mg/mL）、良好的重现性以及与参考MS方法高度一致的结果。这项工作的重要意义在于，它首次提供了一个不依赖复杂质谱仪器、易于在质量控制实验室推广实施的加帽分析方案，为mRNA治疗剂和疫苗的研发与生产过程中的质量监控提供了实用、可靠且易于获取的分析工具，有助于加速mRNA药物的开发进程并确保其批次间的一致性。该方法不仅平衡了分析性能与实际应用考量，也为理解mRNA合成过程中的分子复杂性（如非模板添加）提供了有价值的见解。
