《Journal of Chromatography B》：Development and application of SPE-UHPLC-MS/MS methods for quantification of 29 steroids in rat serum
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类固醇及其代谢物在生殖调节、肿瘤发展和内分泌平衡中起关键作用，但低浓度和结构相似性导致分析困难。本研究开发SPE-UHPLC-MS/MS方法，成功检测29种类固醇代谢物，应用于NMU诱导乳腺癌和大鼠卵巢切除模型，发现雌激素2-羟基化及孕烯醇酮21-羟基化通路异常。
崔海阳|杨东亮|郑永刚|李静|闫海瑞|高晓丽
新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830017，中国
引言
类固醇及其代谢物在生殖调节、内分泌稳态和肿瘤发展中起着至关重要的作用[1]。在多种类固醇中，雌激素、孕激素及其前体因在激素依赖性恶性肿瘤、生殖障碍和代谢调节中的核心作用而受到特别关注，母体激素及其代谢物在相互关联的代谢网络中发挥着不同的生物学功能，这需要进行全面的研究。雌激素在C-2、C-4和C-16位置的羟基化会产生儿茶酚雌激素和16-羟基化代谢物[2]，这些代谢物对细胞增殖和DNA完整性有不同的影响；而儿茶酚-O-甲基转移酶进行的O-甲基化则会产生甲氧基雌激素，从而影响血管生成和肿瘤生长[[3]、[4]、[5]]。孕激素可被还原为5α-二氢孕酮、具有神经活性的3α-二氢孕酮以及20α/20β-二氢孕酮，它们分别调节细胞增殖、GABA能神经传递和妊娠维持[[6]、[7]、[8]]。孕烯醇酮在C-17和C-21位置的羟基化会产生17α-羟基孕烯醇酮和21-羟基孕烯醇酮，这两种物质是雄激素、糖皮质激素和盐皮质激素生物合成的关键中间体[9]。这些途径的失调与卵巢功能障碍[[10]、[11]、[12]]、多囊卵巢综合征[13]、骨质疏松症[14]以及激素依赖性恶性肿瘤[[15]、[16]、[17]]有关。因此，全面分析类固醇及其代谢物对于阐明疾病机制至关重要。
然而，类固醇之间的结构相似性以及它们较低的内源性浓度给分析带来了重大挑战。传统的免疫测定方法由于仅能检测单一分析物且灵敏度和选择性有限[18]，无法全面表征类固醇的多途径代谢网络。液相色谱-质谱（LC-MS）结合化学衍生化已成为类固醇分析的主流方法，该方法具有高通量、高灵敏度和同时检测多个分析物的能力[19]。已经建立了多种方法用于处理不同的人体生物样本，包括血浆、血清、尿液、唾液和毛发[[20]、[21]、[22]、[23]、[24]]，在灵敏度和代谢物覆盖范围方面表现优异。秦等人开发了一种基于衍生化的LC-MS/MS方法，能够高度灵敏地检测29种类固醇，并成功应用于人体血清分析[25]。H?kkinen等人开发了一种可以同时定量23种类固醇的方法，具有极低的定量限，能够覆盖多种人体生物样本中的激素类别[26]。这些方法在临床样本分析和疾病相关研究中显示出良好的适用性。
大鼠是生物医学研究和毒理学评估中的主要模式生物，在药物安全性评估、病理机制阐明和临床前药代动力学/药效学研究中不可或缺。目前，关于大鼠体内类固醇水平的分析方法和系统数据仍然不足，尤其是在疾病模型中的代谢谱方面。然而，直接将临床方法应用于大鼠血清时，由于样本组成差异、去卵巢模型或疾病模型中类固醇基线浓度较低[27,28]以及物种特异性的代谢途径差异，其适用性有限。已经开发了几种用于啮齿动物样本中类固醇分析的LC-MS/MS方法[[28]、[29]、[30]]，但这些方法在检测微量类固醇方面的灵敏度有限，且主要关注皮质类固醇、雄激素和孕激素，对调节雌激素代谢途径和病理生理过程至关重要的羟基化类固醇代谢物的覆盖范围也有限[[31]、[32]、[33]、[34]]。
为了实现全面的途径分析，本研究选择了涵盖雌激素生物合成及其竞争性羟基化/甲基化途径、孕激素分解途径、关键类固醇生成前体以及代表性雄激素的目标分析物，并开发了固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱（SPE-UHPLC-MS/MS）方法。通过优化衍生化策略并采用二维液相色谱来减少缓冲盐引起的离子化抑制，实现了微量类固醇的灵敏检测。该方法经过严格验证，可用于生物分析应用。该验证方法被应用于N-甲基-N-亚硝脲（NMU）诱导的乳腺癌模型和去卵巢大鼠模型的血清代谢谱分析，发现了雌激素2-羟基化和孕烯醇酮21-羟基化途径的变化。这种全面的代谢谱分析能力有助于阐明类固醇代谢途径在疾病发展中的病理生理作用，从而为类固醇相关疾病的临床前研究提供坚实的方法学支持。
方法片段
化学试剂
29种类固醇的参考标准品和11种同位素标记的内标从不同供应商处获得，详细信息见表S1。衍生化试剂，包括丹磺酰氯、羟胺盐酸盐、甲氧胺盐酸盐、1-甲基-1H-咪唑-2-磺酰氯、3-吡啶磺酰氯和Girard's T试剂，购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）、OriLeaf（中国上海）或Aladdin Scientific（中国上海）。衍生化优化
化学衍生化是LC-MS/MS分析类固醇性激素的关键策略，特别是对于那些离子化效率低或内源性浓度低的化合物。衍生化的主要目的包括：（1）通过引入可离子化的官能团来提高离子化效率；（2）通过改变极性和保留行为来改善色谱分离效果。然而，并非所有类固醇都适用于衍生化处理。结论
本研究建立了高灵敏度和特异性的SPE-UHPLC-MS/MS方法，用于定量大鼠血清中的29种类固醇及其代谢物。通过优化样品预处理程序和色谱-质谱检测条件，有效解决了微量类固醇定量中的关键挑战。该方法在准确性、精确度、提取回收率、基质效应和稳定性方面表现良好，满足了所有要求
CRediT作者贡献声明
崔海阳：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、数据分析。杨东亮：方法验证、概念构思。郑永刚：项目监督、资源调配、项目管理。李静：项目监督、资源调配、概念构思。闫海瑞：数据分析、数据管理。高晓丽：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹措。
资助
新疆维吾尔自治区重点研发项目（项目编号：2024B02013–1）和新疆维吾尔自治区卫生健康委员会“天山英才”高级医疗卫生人才培训项目（项目编号：TSYC202301B154）。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
