《Advanced Science》：GbWAKL20 Phosphorylates GbNFYB8 to Modulate Verticillium Wilt Resistance in Cotton
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本研究揭示了棉花细胞膜受体GbWAKL20通过内质网-高尔基体囊泡运输将病原信号传导至细胞核，磷酸化转录因子GbNFYB8并促进其核转位，进而激活MAPK级联和SA信号通路的关键机制。该发现不仅阐明了WAKL家族蛋白调控植物免疫的新范式，更为棉花黄萎病（Verticillium Wilt）抗性育种提供了新型分子靶标。
棉花黄萎病抗性机制的新发现：GbWAKL20-GbNFYB8信号模块的解析
引言背景
由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的黄萎病是制约棉花生产的毁灭性土传病害。细胞膜表面的模式识别受体（PRRs）在植物免疫启动中发挥核心作用，其中细胞壁关联激酶（WAKLs）因其独特的胞外结构域和保守的胞内激酶结构域，成为连接胞外信号感知与胞内免疫应答的关键桥梁。然而，棉花中WAKL家族蛋白调控黄萎病抗性的具体分子机制仍不明确。
GbWAKL20的功能验证
通过基因组学与转录组学联合分析，研究者从海岛棉（Gossypium barbadense）品种Hai7124中鉴定到一个受大丽轮枝菌强烈诱导的WAKL基因——GbWAKL20。病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验表明，沉默GbWAKL20显著降低了棉花的黄萎病抗性，表现为萎蔫叶片比例增加、维管束褐变加剧以及菌丝积累量上升。相反，在拟南芥中异源过表达GbWAKL20则能增强其对大丽轮枝菌的抗性。表达谱分析显示，GbWAKL20在根、茎等易感部位高表达，且其同源基因在不同棉种中均呈现保守的病原诱导表达模式。
GbWAKL20的亚细胞定位与信号传导
蛋白结构分析显示，GbWAKL20具有典型的信号肽、胞外GUB_WAK_bind结构域、跨膜区和胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。亚细胞定位实验证实，GbWAKL20定位于细胞膜、高尔基体和内质网，并发现其可通过高尔基体来源的囊泡动态穿梭于细胞膜与核膜之间。这一发现提示GbWAKL20可能通过内质网-高尔基体途径将胞外信号传递至细胞核。
免疫通路调控机制
转录组学分析表明，沉默GbWAKL20导致1518个差异表达基因（DEGs），其中MAPK级联反应、水杨酸（SA）信号通路等相关基因显著下调。外源SA处理能强烈诱导GbWAKL20表达，且沉默该基因后植株内源SA含量明显降低。在过表达株系中，Vd侵染后MAPK3/6的磷酸化水平持续升高，SA信号通路基因被特异性激活。这些结果说明GbWAKL20通过调控MAPK和SA信号通路协调免疫应答。
GbWAKL20与GbNFYB8的互作机制
酵母双杂交筛选发现，GbWAKL20与核因子YB8（GbNFYB8）存在特异性相互作用。通过双分子荧光互补（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down实验验证了二者在细胞膜、内质网和核周区域的直接互作。值得注意的是，GbNFYB8本身主要定位于核周，但在与GbWAKL20共表达时显著向核内富集。
磷酸化调控核转位
体外磷酸化实验显示，GbWAKL20的胞内激酶结构域具有自磷酸化活性，并能磷酸化GbNFYB8。点突变实验证实，GbNFYB8第76位丝氨酸（S76）是其关键磷酸化位点。当S76突变为丙氨酸（S76A）后，GbWAKL20介导的磷酸化及核转位作用被显著抑制。核蛋白提取实验进一步表明，GbWAKL20通过磷酸化促进GbNFYB8在细胞核内的积累，而不影响其总蛋白水平。
GbNFYB8的转录调控功能
研究表明，GbNFYB8能特异性结合下游基因启动子区的CCAAT顺式元件。双荧光素酶报告系统显示，GbNFYB8可激活含有CCAAT元件的启动子活性，而GbWAKL20能进一步增强该活性。电泳迁移率变动分析（EMSA）证实，GbNFYB8直接结合MAPK3、WRKY40/41/46等免疫相关基因的启动子。沉默GbNFYB8不仅降低棉花对黄萎病的抗性，还导致MAPK级联和激素信号通路基因表达受阻。
防御信号的整合与放大
研究者提出级联放大模型：大丽轮枝菌侵染导致细胞壁降解，释放的信号分子被GbWAKL20胞外域感知，通过激酶域磷酸化GbNFYB8，促进其入核并激活下游MAPK3和WRKY转录因子。这些因子进一步调控病程相关蛋白、细胞壁修饰酶及次生代谢物合成基因的表达，最终形成多维度的防御网络。
讨论与展望
该研究首次揭示WAKL家族蛋白通过磷酸化转录因子直接调控核基因表达的新模式，突破了传统认知中膜受体仅通过激酶级联传递信号的局限。GbWAKL20-GbNFYB8模块的发现为理解植物免疫信号跨膜转导提供了新视角，也为棉花抗病育种提供了双靶点策略。未来研究可聚焦于GbWAKL20识别的具体配体分子，以及该模块与其他免疫通路的交叉调控机制。
实验方法亮点
研究采用多技术平台验证分子机制：通过VIGS技术实现棉花基因功能缺失分析，利用拟南芥过表达系统验证基因功能保守性；结合磷酸化蛋白质组学与点突变技术精确定位关键磷酸化位点；采用双荧光素酶报告系统、EMSA等技术解析转录调控机制。这些方法为植物免疫研究提供了可借鉴的技术范式。
