细胞质HOW(S)蛋白通过识别CUAAC基序调控果蝇精原细胞RNA稳定性的机制研究

《Communications Biology》：Held out wings RNA binding activity in the cytoplasm during early spermatogenesis

本研究针对果蝇精原细胞中RNA结合蛋白Held out wings（HOW）的胞质亚型HOW(S)功能未知的问题，通过RIP-seq技术鉴定出121个HOW(S)结合mRNA靶点，发现其3'-UTR富集(A/G/U)CUAAC基序，并证实该基序介导的HOW结合可双向调控mRNA稳定性及翻译。研究揭示了STAR家族蛋白在精子发生早期阶段通过胞质RNA网络调控信号通路的全新机制，为生殖干细胞命运决定提供了新视角。

　　

在生命科学领域，生殖干细胞的命运调控始终是核心议题。果蝇（Drosophila melanogaster）作为经典模式生物，其睾丸中的生殖干细胞（Germ Stem Cells, GSCs）为研究干细胞自我更新与分化提供了理想模型。在这一过程中，RNA结合蛋白（RNA-Binding Proteins, RBPs）通过转录后调控机制扮演着关键角色。其中，STAR（Signal Transduction and Activation of RNA）蛋白家族成员Held out wings（HOW）因其在胚胎发育、胶质细胞成熟及精子发生中的重要作用而备受关注。然而，HOW存在多个亚型，其核内亚型HOW(L)的功能已有较多研究，而主要定位于细胞质的短亚型HOW(S)的RNA结合特性及功能机制仍属未知。尤其在精子发生早期阶段，HOW(S)如何在胞质中通过识别特定RNA基序调控靶基因表达，进而影响干细胞稳态，成为领域内亟待解决的科学问题。

为系统解析HOW(S)的分子功能，英国利兹大学Julie L. Aspden团队在《Communications Biology》发表最新研究。该研究首先利用UAS/GAL4系统在果蝇睾丸GSCs和精原细胞中特异性表达HA标签的HOW(S)，并通过RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）技术，筛选到121个与HOW(S)直接结合的mRNA靶点。基因本体（GO）分析显示这些靶点显著富集于细胞信号转导通路，如Hippo、Notch等。进一步的基序分析发现，HOW(S)结合的mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）高度富集(A/G/U)CUAAC基序，而5'-UTR则富集GCG(A/U)G基序。通过荧光各向异性（Fluorescence Anisotropy, FA）实验，团队证实HOW的STAR结构域能以纳摩尔级亲和力特异性结合lola和hipk mRNA中的CUAAC基序，但对5'-UTR的GCG(A/U)G基序无显著亲和力，提示后者可能通过与其他RBPs（如SLIRP1）相互作用间接招募HOW(S)。功能实验表明，在果蝇S2细胞中敲低HOW(S)可导致部分靶mRNA（如lola、Syx1A）稳定性上升，而另一些靶点（如Anp32a）的mRNA水平下降，证明HOW(S)对mRNA的调控具有双向性。蛋白质组学数据进一步揭示，HOW(S)还能在翻译水平调控靶基因（如Bacc）表达。这些结果共同描绘了HOW(S)通过结合3'-UTR CUAAC基序，在胞质中动态调控mRNA稳定性与翻译的分子图景，为理解STAR蛋白在生殖干细胞微环境中的作用提供了新范式。

本研究的关键技术方法包括：利用UAS/GAL4系统实现果蝇睾丸组织特异性表达HA标签蛋白；通过RIP-seq从1000对睾丸组织中鉴定RNA-蛋白互作网络；采用重组表达的HOW-STAR结构域进行FA定量分析结合亲和力；结合RNA干扰（RNAi）和蛋白质组学（DIA-MS）在S2细胞中验证功能；使用MEME Suite进行基序富集分析。

HOW(S)结合RNA的特征与功能验证

通过triplicate RIP-seq实验，研究团队发现121个mRNA与HOW(S)特异性结合，其中46%的靶点3'-UTR含有(A/G/U)CUAAC基序。FA实验证实，HOW-STAR结构域对hipk mRNA中GCUAAC基序的亲和力（K_D=10.1 nM）受基序首位核苷酸影响，突变实验显示偏好A（K_D=4.65 nM）而非G/U/C，且第四位A→G突变（K_D=85.3 nM）显著削弱结合，凸显CUAAC核心序列的关键作用。

HOW(S)对mRNA稳定性的双向调控机制

在S2细胞中敲低HOW(S)后，lola、Syx1A等mRNA水平上升，提示HOW(S)通常起 destabilizing 作用；而Mapmodulin（Anp32a）mRNA水平下降，表明其对部分靶点具稳定功能。蛋白质组学进一步发现eIF3c等靶标在mRNA无变化时蛋白水平改变，揭示HOW(S)还具有翻译调控潜能。这种功能多样性可能取决于结合位点数量、位置及协同作用蛋白。

结论与意义

本研究首次在精子发生早期阶段绘制了胞质HOW(S)的RNA互作图谱，揭示了CUAAC基序介导的转录后调控网络。不仅完善了STAR蛋白家族在不同细胞区室中的功能分工理论（核内HOW(L)调控剪接，胞质HOW(S)调控稳定性），还为生殖干细胞稳态失衡相关生殖疾病提供了潜在分子靶点。该研究策略为解析RBPs在时空特异性调控中的机制提供了可借鉴范式。