《Aging Cell》：Frequently Reported Blood Biomarkers in Sarcopenia Clinical Trials: A Systematic Review and Meta-Analysis
背景
少肌症是一种以肌肉质量和力量进行性丧失为特征的疾病，由欧洲少肌症工作组（EWGSOP2）定义。尽管少肌症在2016年被国际疾病分类正式认定为一种疾病，但其定义仍缺乏全球共识，这影响了流行病学估计，例如65岁以上人群的患病率在10%到22%之间。少肌症不仅显著降低生活质量，还增加跌倒、骨折、住院、功能衰退和死亡风险，同时给医疗系统带来沉重经济负担。随着全球人口快速老龄化，受影响个体数量预计将在未来几年急剧上升，使少肌症成为一个重大的全球公共卫生问题。
少肌症的病理生理学涉及肌肉代谢中合成代谢和分解代谢因子失衡。关键合成代谢调节因子如睾酮、生长激素和胰岛素样生长因子1（IGF-1）促进肌肉蛋白质合成和再生，而肌肉生长抑制素（GDF-8）和激活素A等分解代谢因子则抑制肌肉生长并增加肌肉分解。作为一种潜在可逆的疾病，少肌症可通过运动、营养和药物治疗等方法进行管理，但目前尚无获批的药物。临床研究面临的主要挑战之一是与肌肉质量、力量和身体功能相关的结局指标不一致，导致不同研究结果难以比较。
为了改善少肌症生物标志物测量的研究间可比性，一个专家小组于2023年在世界卫生组织合作中心的支持下达成共识，发布了一份清单，列出了在评估少肌症新化学实体的II期和III期临床试验中应理想测量的肌肉骨骼健康和衰老的生物化学标志物。专家们进一步将生物标志物分为肌肉骨骼生化标志物、神经肌肉接头标志物和肌肉周转标志物。与炎症、脂肪因子和激素相关的生物标志物也被认为与少肌症相关。
在此背景下，本工作旨在通过系统综述，识别当前少肌症RCT中报告的血液生物标志物清单，并采用荟萃分析模型，初步分析所提出的干预措施对专家共识论文中推荐的肌肉特异性BBM和其他BBM的影响。
方法
本系统综述和荟萃分析遵循系统综述和荟萃分析优先报告项目（PRISMA 2020）的要求进行和报告。研究方案已在PROSPERO注册（编号：CRD42024603238）。综述根据PICOs框架设计：人群（P）为60岁及以上（平均样本年龄超过60岁或结果单独报告给60岁及以上个体）且经至少测量少肌症两个关键参数（如肌肉质量 + （肌肉力量或身体功能））诊断的少肌症成人；干预措施（I）为旨在管理少肌症患者的任何类型干预（营养、运动、药物、联合/其他干预）；对照（C）为任何类型的对照（常规护理、标准护理、任何对照干预）；结局（O）为血液生物标志物测量；研究设计（S）为随机对照试验。
文献检索于2024年3月在MEDLINE（通过Ovid）、Cochrane对照试验中心注册库（通过Ovid）和Embase数据库中进行，结合Mesh术语和关键词以识别所有经同行评审并发表的旨在管理少肌症的随机对照试验。在这些RCT中，仅那些报告了BBM且基线值和随访值均可用的研究被纳入本系统综述。除了书目数据库的检索策略外，还进行了手动检索，评估纳入文章的参考文献以及先前发表类似主题的系统综述的参考文献，并联系该领域的专家以丰富文献检索。
研究筛选首先基于标题和摘要进行，由两名独立评审员使用纳入标准作为筛选决策工具独立进行。筛选的第二步是阅读初步纳入阶段所选文章的全文。筛选过程中的分歧通过两名评审员之间的共识或第三名独立评审员的介入解决。
数据由三名评审员以轮换配对的方式独立提取，并编码到标准化的Excel文件中。提取的信息包括文章信息（如第一作者、标题和发表年份）、人群特征（如人群描述和少肌症诊断）、结局（如生物标志物测量和结果）、评论、资助、利益冲突和结论。分歧通过共识解决，必要时寻求额外评审员帮助。当数据缺失时，会联系个别文章的作者。
由于观察到的BBM类型存在异质性，为便于组织信息，将BBM分为4个亚组：（1）ESCEO指南推荐的肌肉特异性BBM；（2）ESCEO指南推荐的非肌肉特异性BBM；（3）在RCT中识别到但ESCEO指南未推荐的额外肌肉特异性BBM；（4）ESCEO指南未推荐的非肌肉特异性BBM。对落入前三个类别且在至少两个RCT中报告的所有BBM进行了荟萃分析。其他生物标志物采用叙述性综合进行总结。初步分析包括了最大数量的RCT，无论干预对主要结局的影响如何。随后进行了第二次更严格的分析，仅关注那些证明肌肉质量和/或肌肉力量有显著改善的研究，旨在识别在改善少肌症关键参数方面有效的干预后BBM的潜在变化。
由于预期血液生物标志物测量和少肌症定义在不同研究间存在异质性，选择了随机效应模型。从纳入的RCT中提取每个研究组各生物标志物的平均浓度和标准差（SD）。当原始论文中数据缺失或未以均数和SD表示时，首先联系作者以获取缺失或适当格式的值。如果无法获得数据，则使用多种方法将所有入选文章纳入综述，并确保收集数据的 exhaustivity。当报告的是p值或95%置信区间而非SD时，使用Cochrane系统综述手册第7.7.3节中描述的方法。如果提到中位数和四分位数范围，则使用发表为“从五数概括估计样本均数和标准差（SD）及其在荟萃分析中的应用”的方法将值反向转换为均数和SD。由于RCT中测量生物标志物使用了不同的单位、测量方法和自动化设备，使用标准化均数差（SMD）和95%置信区间（CI）报告干预前后各生物标志物浓度的差异。
根据荟萃分析的理论原则，一个个体不能在荟萃分析中重复出现。因此，在RCT包含多个干预组与单一对照组比较的情况下，将相关干预组合并以避免参与者重复分析。使用Cochran's Q统计量和I2统计量评估结果内的异质性。当有足够数量的RCT时，根据干预类型（运动、营养、药物和联合/其他干预）进行亚组分析以进一步研究异质性。然后，使用漏斗图和Egger's回归不对称检验评估发表偏倚，该检验在包含至少6个RCT的荟萃分析中进行。当漏斗图和Egger's检验证明存在显著异质性时，进行Trim and Fill统计分析。最后，为测试模型在每次剔除一项研究时的稳健性，进行了留一法敏感性分析。所有统计分析均在R软件（R-4.4.2）上的RStudio中使用适当的包（meta）进行，显著性水平设定为p值≤0.05。
使用Cochrane RoB2.0工具由三名独立评审员以轮换配对的方式评估RCT的偏倚风险，在存在分歧时通过共识或第三方介入解决。Cochrane RoB2.0工具评估以下5个领域：随机化过程、偏离预期干预、结局数据缺失、结局测量和报告结果的选择。为每篇纳入的文章提供每个领域的判断和总体偏倚风险判断，研究被评为低偏倚风险、有些担忧或高偏倚风险。当研究未发表方案时，领域5自动评为“有些担忧”。同样，当研究非双盲时，领域2也自动评为“有些担忧”。
结果
文献检索与研究特征
从电子数据库共识别出3985篇参考文献。去除重复后，根据标题/摘要对2743篇参考文献进行资格评估，其中147篇进一步进行全文评估。共识别出58项旨在管理少肌症的RCT。在全文筛选阶段排除的研究及其排除原因可在OSF上获取。在这58项研究中，仅21项RCT（36.2%）测量了至少一种BBM。最终纳入本系统综述的21项RCT的特征见表1。这21项测量至少一种BBM的RCT，发表于2016年11月至2024年3月之间，共汇集了1902名少肌症参与者，其中对照组936人，干预组966人。入选RCT的中位样本量为53人（四分位距[IQR] = 34, 90），干预中位时长为12周（IQR = 8, 13）。关于少肌症的定义，大多数研究使用AWGS定义（7项RCT, 33.3%）、EWGSOP标准（4项RCT, 19.0%）或EWGSOP2标准（2项RCT, 9.5%）。
关于干预类型，6项RCT（28.6%）使用营养干预，6项（28.6%）使用运动干预，9项（42.9%）使用两者结合或其他类型干预。没有药物干预。每项RCT报告的中位主要终点数为2个（范围每项研究1-9个主要终点）。BBM在14项RCT中作为主要终点之一进行评估，在其他RCT中作为次要终点。仅1项RCT报告专门为安全性测量了BBM，1项RCT报告将某些BBM作为探索性测量。
21项纳入本系统综述的RCT中，有10项（47.7%）未能证明所提出的干预措施对所有主要终点有任何显著改变。关于偏倚风险评估，12项RCT被评为“低风险”偏倚研究，6项RCT被归类为“存在一些偏倚风险担忧”，3项RCT为高偏倚风险。
生物标志物报告的频率
在21项RCT中共测量了47种不同的BBM，每项研究中位数为4种BBM。最常报告的BBM是C反应蛋白（CRP）（8/21项RCT, 38.1%）、白细胞介素6（IL-6）（7/21项RCT, 33.3%）、肿瘤坏死因子α（TNFα）（6/21项RCT, 28.6%）、25-羟基维生素D（6/21项RCT, 28.6%）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）（5/21项RCT, 23.8%）、白蛋白（5/21项RCT, 23.8%）、空腹血糖（4/21项RCT, 19.0%），以及丙氨酸氨基转移酶（ALAT）、总胆固醇、肌酐和IL-10（各3/21项RCT, 14.3%）。在所有RCT中，生物标志物使用不同的方法和自动化设备进行测量，导致生物标志物水平以不同单位表示，并且具有不同的灵敏度、特异性和准确度。
在21项少肌症管理RCT中，只有2项（9.5%）测量了ESCEO指南推荐的肌肉特异性生物标志物之一，即GDF-15、GDF-8和卵泡抑素。其他推荐的肌肉特异性生物标志物均未在任何纳入的RCT中测量。
干预对BBM浓度的影响
ESCEO指南推荐的肌肉特异性BBM（卵泡抑素、GDF-8、GDF-15）
从ESCEO指南推荐的肌肉特异性BBM列表中，只有卵泡抑素、GDF-8和GDF-15在当前旨在管理少肌症的RCT中得到测量，每项均由2项使用运动作为干预的RCT报告。使用荟萃分析模型，所研究的干预措施均未对这三种BBM产生显著影响。
ESCEO指南推荐的非肌肉特异性BBM（CRP、IL-6、TNFα、IGF-1）
在ESCEO指南推荐的非肌肉特异性BBM中，CRP在8项RCT中测量，IL-6在7项RCT中测量，TNFα在6项RCT中测量，IGF-1在5项RCT中测量。未发现干预对IL-6、CRP和TNFα有显著影响。观察到RCT干预对IGF-1浓度有中等显著影响，SMD为0.46（95% CI = [0.04; 0.88], p = 0.0326）。该模型存在显著异质性（I2 = 70.3%, Q检验p值=0.0092）。留一法分析显示，剔除de Sa Souza等人（2022）的研究后，总体SMD增加（SMD = 0.56 vs. SMD = 0.46）。亚组分析未揭示所用干预类型对IGF-1浓度存在差异。该模型未发现发表偏倚。
ESCEO指南未推荐的肌肉特异性BBM（CAF）
除了ESCEO指南中推荐的肌肉特异性BBM列表外，在RCT组中还识别出另一种肌肉特异性BBM，即癌症相关成纤维细胞（CAF）（n=2）。所提出的干预措施未影响该BBM。
ESCEO指南未推荐的非肌肉特异性BBM（ALAT、白蛋白、ASAT、钙、胆固醇、肌酐、空腹血糖、HDL、IL-1RA、IL-8、IL-10、胰岛素、LDL、甘油三酯、25-(OH)-维生素D）
25-羟基维生素D浓度在6项RCT中测量；其中3项为营养干预，另外3项为联合干预。观察到RCT中25-羟基维生素D普遍增加，但由于RCT期间参与者补充了维生素D，未在荟萃分析模型中研究该BBM。在2项RCT中报告的钙也观察到类似现象。
白蛋白在5项RCT中定量，其中2项为营养干预，另外3项为联合干预，RCT内部结果矛盾。同样，空腹血糖在4项联合干预RCT中测量，关于空腹血糖浓度的结果相互矛盾。
胆固醇、肌酐和ALAT浓度在3项RCT中评估。对于胆固醇，2项RCT涉及联合干预，1项涉及营养干预，而测量ALAT和肌酐的所有3项RCT均为联合干预研究。干预后胆固醇和ALAT浓度普遍增加，而肌酐的结果在RCT间不一致。
HDL、LDL和甘油三酯在2项RCT中评估；一项为营养干预，另一项为联合干预。干预后LDL浓度普遍增加，而HDL和甘油三酯浓度在RCT内的结果相互矛盾。
IL-1Ra、IL-8、IL-10、胰岛素、ASAT在2项RCT中评估。ASAT、IL-10和IL-1Ra的结果在RCT内部矛盾，而干预后胰岛素浓度普遍增加，IL-8浓度降低。
在证明少肌症关键指标有显著改善的RCT中BBM的演变
在纳入本荟萃分析的21项RCT中，有14项报告干预后肌肉质量和/或肌肉力量有显著改善。具体观察这组研究，CRP和25-羟基维生素D在其中的3项RCT中受到显著影响。白蛋白和卵泡抑素浓度在后者中的两项RCT中受到影响，而GDF-8、GDF-15、CAF、TWEAK、Myf5、Myog、Pax3、Pax7、IL-1RA、肌酐、IL-2、LDL胆固醇、维生素E和IGF-1在其中一项中受到影响。
对仅包含证明肌肉质量和/或肌肉力量有显著改善的RCT进行了一项荟萃分析，针对ESCEO推荐的BBM。对IL-6、CRP、TNFα和IGF-1进行了荟萃分析模型，均未能证明少肌症特异性干预有任何显著效果。
讨论
我们的系统综述确定了58项旨在管理少肌症的研究。这些RCT中提出的干预措施主要是基于运动的干预和基于营养的干预。在这58项研究中，只有21项RCT报告了BBM测量，且没有研究评估少肌症治疗的新化学实体。在21项RCT中，在基线和随访时测量了47种不同的BBM，每项研究评估的中位生物标志物数为4种。本综述中识别出的不同BBM数量之多，证实了Van Heden等人论文中强调的少肌症结局的异质性，该论文确定了253种不同的少肌症诊断结局。该系统综述加强了对少肌症统一核心结局集的需求。
除了识别的BBM数量存在显著异质性外，BBM与肌肉生理学的生物学相关性也观察到重要异质性。21项试验中只有7项（33.3%）包含了至少一种肌肉特异性生物标志物。其余试验（66.7%）仅关注非肌肉特异性生物标志物。
尽管跨研究评估的BBM范围很广，但纳入的研究均未符合欧洲骨质疏松症、骨关节炎和肌肉骨骼疾病临床与经济学会（ESCEO）和学术健康研究与实验中心（CARES SPRL）最近发布的建议。这些建议提出了一个最低限度的生物标志物 panel，以标准化少肌症试验的结局报告，区分肌肉特异性BBM（如肌肉生长抑制素-卵泡抑素、BDNF、PIIINP和少肌症指数）和系统性病理生理过程标志物（如IGF-I、DHEA、皮质醇、CRP、IL-6和TNF-α）。在指南发布时发表的文献中并未检索到ESCEO和CARES SPRL提出的所有BBM。我们分析中观察到的对这些指南的缺乏遵守是预期的，因为许多纳入的RCT是在这些建议发布之前进行的。其次，该指南是专门为评估少肌症新化学实体的RCT设计的，而我们分析中纳入的RCT均未调查此类干预。
在本荟萃分析中，我们还初步调查了干预措施对BBM变化的影响。为此，根据ESCEO指南分类，将BBM分类为肌肉特异性或非肌肉特异性BBM。本荟萃分析中包含的ESCEO指南推荐的肌肉特异性BBM是GDF-15、GDF-8和卵泡抑素。基于数据可用性，卵泡抑素和GDF-8在本组中单独纳入，即使ESEO建议将它们作为一对进行测量。对每种这些BBM进行的荟萃分析在本初步调查中未证明少肌症干预对其浓度有显著影响。在ESCEO指南推荐的非肌肉特异性BBM中，本荟萃分析包含了IGF-1、CRP、IL-6和TNFα。少肌症干预显著影响IGF-1浓度，而CRP、IL-6和TNFα浓度未受影响。这些结果与评估少肌症炎症BBM的其他论文总体矛盾。然而，与本研究不同，在Bano等人和Picca等人的论文中，生物标志物浓度在少肌症个体和无非少肌症对照组之间存在统计学差异。ESCEO推荐的其他几种BBM未在任何纳入的RCT中评估，包括脂联素、瘦素、硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）和皮质醇，而睾酮仅在一项RCT中测量。同样，我们分析中的任何RCT均未测量III型前胶原氨基末端肽（PIIINP）、脑源性神经营养因子（BDNF）或少肌症指数。这凸显了需要在少肌症RCT中进一步评估这些BBM。
解释荟萃分析结果时应考虑不同因素。一些荟萃分析模型可能由于纳入研究数量有限，因此参与者数量少而缺乏统计效力。纳入的RCT质量被认为，21项RCT中有9项存在一些担忧至高偏倚风险。然而，敏感性分析表明，质量较差的研究并未驱动荟萃分析模型。此外，模型间观察到高度异质性，这可能归因于干预方案的差异、BBM测量方法的不同、RCT持续时间的差异以及干预对少肌症相关健康结局疗效的差异。此外，每项研究报告的大量主要终点使BBM特异性效应的解释复杂化。
尽管如此，为进一步探讨这方面，我们进行了一项二次分析，将证据体限制在证明少肌症关键临床参数有显著改善的研究，即那些显示肌肉力量或肌肉质量至少有一项显著改善的研究。在14项报告肌肉质量和/或力量改善的RCT中，几种生物标志物表现出不同的模式。发现干预后GDF-8、TWEAK、CRP和IL-2浓度降低，而GDF-15、卵泡抑素、CAF、Myf5、Myog、Pax3、Pax7、25-羟基维生素D、LDL、维生素E和IGF-1随着临床改善而增加。25-羟基维生素D浓度的增加可能仅反映了RCT参与者有效的维生素D补充。关于白蛋白的结果不一致。最后，当对证明肌肉质量和/或肌肉力量有显著改善的RCT中ESCEO推荐的BBM进行荟萃分析时，IL-6、CRP、TNFα仍不受少肌症特异性干预的影响。此外，虽然考虑所有纳入的RCT时IGF-1显示出显著反应，但当分析仅限于那些报告肌肉质量和/或力量改善的研究时，这种效应不再显著。这种差异可能通过仅将证明肌肉质量和/或力量显著改善的RCT纳入荟萃分析时，丢失了大样本量的RCT来解释。需要进一步证据以更好地了解IGF-1对少肌症的诊断准确性。
这项工作的一个重要方面需要考虑的是，通常不清楚某些生物标志物是为安全性还是有效性目的而测量。在本综述纳入的RCT中，只有Yang等人的研究明确报告将生物标志物用于安全性监测。这种模糊性对于肾脏和肝脏生物标志物尤为明显，这些标志物在出于安全性目的测量时通常预期保持稳定。肌酐是一个相关的例子。虽然它常规用于临床评估肾功能，但在少肌症背景下也可用作肌肉质量的标志物。这凸显了在少肌症研究中区分安全性和有效性生物标志物的挑战，特别是在非药物干预中。此外，纳入的RCT均未评估药物干预，这可能解释了缺乏与安全性结局相关的生物标志物分类。
局限性
本研究存在几个方法学局限性需予以承认。首先，如前所述，跨研究血液生物标志物测量存在显著异质性，源于测定技术、分析平台、报告单位和RCT持续时间的差异。为解决此问题，我们在荟萃分析模型中应用了SMD以促进跨研究比较。由于纳入荟萃分析的RCT数量较少，无法进行GRADE分析评估，这也适用于发表偏倚评估。其次，对生物标志物反应性的解释因许多纳入的RCT未能证明其主要临床终点有显著改善而复杂化。此外，生物标志物常作为次要结局报告，引发这些试验是否具有足够效力检测生物标志物水平变化的担忧。尽管替代终点应理想地包含在具有足够效力的分析中，但有限的报告和BBM测量的变异性可能削弱了统计敏感性。此外，在RCT干预中位时长12周的情况下，证明少肌症关键指标发生显著变化似乎是一个相当大的挑战。未就该参数进行亚组分析。最后，我们的分析未能确定BBM对少肌症靶向干预的反应性，这可能反映了生物标志物选择不当、研究设计异质或干预措施本身疗效有限的综合影响。
结论
本系统综述和荟萃分析强调了当前少肌症研究中BBM使用的局限性。所评估的生物标志物均未表现出足够的一致敏感性或特异性，以支持其常规用作替代疗效终点或作为少肌症的可靠结局测量或诊断工具。因此，我们重要地倡导进行更精心设计的、包含肌肉特异性生物标志物的RCT，以完善对其相关性的理解，并最终改善少肌症管理中以生物标志物驱动的方法。我们的发现强调了操作现有生物标志物指南和开发少肌症干预试验统一核心结局集（COS）的必要性。此类标准化工作对于增强研究间可比性、支持监管协调和促进识别预测有意义的临床结局的稳健生物标志物特征至关重要。最终，提高生物标志物研究的方法学严谨性将加速靶向干预的开发，并有助于更有效和资源高效地管理少肌症。
