NMNAT1通过激活自噬延缓D-半乳糖诱导的耳蜗毛细胞衰老

《Aging Cell》：NMNAT1 Activates Autophagy to Delay D-Galactose-Induced Aging in Cochlear Hair Cells

本文揭示了烟酰胺核苷酸腺苷转移酶1（NMNAT1）在年龄相关性听力损失（ARHL）中的关键作用。研究发现，在D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老模型中，NMNAT1表达下调导致NAD+水平降低和自噬（Autophagy）功能受损。过表达NMNAT1可通过激活自噬流、改善三羧酸循环（TCA）代谢紊乱，从而延缓毛细胞衰老。该研究为ARHL的防治提供了新的潜在靶点。

　　

1 引言

随着人口老龄化加剧，年龄相关性听力损失（ARHL）的发病率持续上升。ARHL是影响老年人的最常见感觉障碍，临床表现为双侧对称性听力下降，通常从高频开始，逐渐累及中低频。超过65%的60岁以上老年人存在不同程度的听力损失，这种损害可能导致社交孤立、沟通障碍、抑郁甚至认知能力下降。ARHL的发病机制尚不完全清楚，亟需深入研究以阐明其潜在机制并改善临床诊疗。

ARHL是一种慢性、年龄相关的疾病，由听觉系统内有害病变和功能障碍的累积效应引起。耳蜗是ARHL的主要病理部位，其特征性改变包括毛细胞和螺旋神经节神经元的损伤。耳蜗血管化减少、DNA损伤、活性氧（ROS）积累和线粒体功能障碍是导致耳蜗病变的主要原因。随着衰老，细胞代谢和自我修复能力减弱，导致受损细胞器和错误折叠蛋白积累。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是维持能量代谢和线粒体稳定性相关酶功能的辅因子。值得注意的是，NAD⁺水平随着年龄增长而下降。在老年小鼠的毛细胞中，总NAD⁺水平和NAD⁺/NADH比值均显著降低。短期和长期补充NAD⁺可增强毛细胞与听觉神经元之间的突触连接，从而缓解ARHL。

巨自噬（以下简称自噬）对于维持蛋白质稳定性、细胞器完整性以及整体细胞健康和活力至关重要。衰老细胞中自噬水平下降，同时伴随NAD⁺水平降低。增加NAD⁺库或增强自噬本身有助于延缓衰老过程。NAD⁺在调节细胞自噬中起着关键作用，Sirtuin 1（SIRT1）通过NAD⁺依赖的组蛋白去乙酰化激活各种自噬相关蛋白。研究表明，老年小鼠毛细胞中SIRT1表达和自噬水平降低，激活SIRT1可通过去乙酰化自噬相关蛋白9A（ATG9A）来增强自噬，从而减轻年龄相关的毛细胞损失。然而，ARHL中自噬调控的机制仍需进一步评估。

烟酰胺核苷酸腺苷转移酶1（NMNAT1）是NAD⁺生物合成中的关键酶，负责维持细胞内NAD⁺水平和NAD⁺/NADH比值。在 Werner 综合征中，Nmnat1的转录抑制会降低NAD⁺水平，从而加速衰老，而补充NAD⁺可显著缓解加速衰老表型。在缺氧应激下，NMNAT1过表达可增强自噬并保护神经元树突免受缺氧诱导的损伤。此外，NMNAT1激活可通过调节SIRT1/mTOR通路诱导自噬，从而预防老年大鼠的急性缺血性卒中。在阿尔茨海默病（AD）中，NMNAT1过表达通过激活自噬促进淀粉样蛋白清除。然而，NMNAT1在ARHL中的具体作用尚不清楚。

本研究旨在评估NMNAT1与自噬在ARHL小鼠中的调控关系。使用D-半乳糖（D-gal）诱导HEI-OC1细胞和耳蜗外植体衰老，以建立ARHL模型。研究结果证实，在D-gal诱导的ARHL模型中，NAD⁺和自噬水平显著降低。NMNAT1过表达可恢复自噬活性并延缓耳蜗毛细胞衰老。这些发现为理解NMNAT1、自噬和衰老之间的关系提供了新的见解，并揭示了NMNAT1作为ARHL临床管理的潜在治疗靶点。

2 材料与方法

本研究使用了Friend Virus B-type（FVB）小鼠，从北京斯贝福生物技术公司购买，饲养于合肥综合性国家科学中心健康与医学研究所的实验动物医学核心设施。取出生后第3天（P3）的FVB小鼠用于耳蜗外植体培养。FVB小鼠因其遗传背景明确、繁殖力高、产仔数多而被选为实验动物，确保了实验动物来源的一致性和充足性。

耳蜗被解剖后立即置于预冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中。在解剖显微镜下，用镊子小心去除耳蜗蜗壳，并轻柔地分离基底膜和螺旋韧带。随后，将基底膜从螺旋韧带上分离，粘附在预先涂有Cell-Tak的8毫米玻璃载玻片上，并转移到4孔培养皿中。每孔含有2毫升杜尔贝科改良 Eagle 培养基（DMEM），并补充1% N2、2% B27和50微克/毫升氨苄青霉素。培养物在37°C、5% CO₂条件下孵育。所有动物实验均严格按照安徽医科大学制定的实验动物伦理指南进行。

HEI-OC1细胞购自广州赛业生物科技有限公司。细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）和50微克/毫升氨苄青霉素的DMEM中，于33°C、10% CO₂培养箱中维持。当细胞密度达到约90%时，使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化成单细胞悬液，用于传代和后续实验。

采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞活力。将HEI-OC1细胞接种于96孔板中，培养12-24小时。待细胞密度达到60%-70%时，用含有2、5、10、20和40毫克/毫升D-gal的DMEM处理72小时。随后，每孔加入100微升含有10% CCK-8溶液的DMEM。在37°C孵育2小时后，使用酶标仪测量450纳米处的吸光度。细胞活力计算公式为：细胞活力（%）=（[As-Ab]/[Ac-Ab]）×100%，其中As代表实验孔（含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物）的吸光度，Ac代表对照孔（含细胞、培养基和CCK-8溶液，无药物）的吸光度，Ab代表空白孔（含培养基和CCK-8溶液，无细胞和药物）的吸光度。

使用MitoBright ROS Deep Red-线粒体超氧化物检测试剂盒和ROS Assay Kit-高灵敏度DCFH-DA检测活性氧（ROS）水平。HEI-OC1细胞用D-gal（5和20毫克/毫升）处理72小时后，移除培养基并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗两次。随后，与Mito-SOX或DCFH-DA试剂在37°C孵育30分钟。然后，将细胞封片用于共聚焦成像或进行流式细胞术分析。

通过蛋白质印迹法（Western Blotting）检测蛋白表达。使用RIPA缓冲液从HEI-OC1细胞和耳蜗外植体中提取蛋白质，并使用蛋白酶抑制剂混合物。采用BCA增强型蛋白测定试剂盒估算蛋白浓度。本研究中使用的一抗包括：兔抗β-微管蛋白、兔抗β-肌动蛋白、小鼠抗GAPDH、兔抗衰老标记蛋白30（SMP30）、兔抗Lamin B1、兔抗γ-H2A.X、兔抗P21、兔抗P16、兔抗NMNAT1、兔抗LC3B、兔抗P62、小鼠抗自噬相关蛋白7（ATG7）和兔抗BECLIN1。使用的二抗为抗兔IgG和抗小鼠IgG。使用天能凝胶成像系统观察蛋白条带，并使用ImageJ软件进行定量，以微管蛋白或肌动蛋白作为内参。

进行免疫荧光染色分析。细胞或耳蜗外植体使用4%多聚甲醛固定。样品用PBST（含有1% Triton X-100的PBS）透化30分钟，用10% FBS封闭1小时，并在4°C下与适当稀释的一抗孵育过夜。用PBST清洗三次后，样品在室温下与适当稀释的二抗孵育2小时。封片前使用DAPI对细胞核进行染色。使用共聚焦显微镜拍摄荧光图像。

采用半定量方法分析外毛细胞（OHCs）的免疫标记信号。使用ImageJ软件对共聚焦图像中OHCs的NMNAT1荧光线性范围进行半定量。根据肌球蛋白7a（myosin7a）染色勾勒出单个OHCs，测量NMNAT1荧光灰度值并减去背景，计算每个OHC的平均灰度强度，并将相对灰度强度归一化至对照组。

使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行SA-β-gal染色。细胞和耳蜗外植体暴露于D-gal 72小时后，移除培养基并用PBS清洗。随后加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。吸弃固定液，用PBS或HBSS清洗三次，每次3分钟。随后加入1毫升染色液，样品在37°C下孵育过夜。

使用增强型NAD⁺/NADH检测试剂盒测量NAD⁺/NADH水平。弃去细胞培养基，每百万细胞加入200微升NAD⁺/NADH提取缓冲液。细胞裂解后，收集上清液。将样品用NAD⁺/NADH提取液稀释5倍，转移至96孔板测定总NAD⁺和NADH水平。取100微升稀释样品在60°C孵育30分钟以降解NAD⁺，然后加入20微升提取缓冲液测定NADH水平。NAD⁺浓度计算公式为：[NAD⁺] = （[NAD⁺] + [NADH]） ? [NADH]。

与上海鹿明生物科技有限公司合作进行蛋白质组学分析。样品制备时，HEI-OC1细胞暴露于D-gal（20毫克/毫升）72小时。细胞用预冷PBS清洗三次，胰蛋白酶-EDTA消化后，将PBS加入细胞悬液。离心后弃去PBS，细胞沉淀在液氮中速冻，并储存于-80°C直至干冰运输进行蛋白质组学分析。进行蛋白质组谱分析时，从样品中提取总蛋白质。留出一部分用于通过SDS-PAGE进行蛋白质定量和质量控制。剩余部分用胰蛋白酶消化并使用Tandem Mass Tag（TMT）试剂进行标记。将等量的每种TMT标记样品合并，然后通过色谱进行分级分离。所得肽段使用Easy-nLC 1100系统耦合Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。原始数据使用Proteome Discoverer 2.4进行处理，在蛋白质和肽段水平应用错误发现率（FDR）阈值0.01。经过质量控制和预处理后，在表达和功能水平进行分析。具体而言，鉴定差异表达蛋白，随后进行基因本体论（GO）富集分析、通路分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。

使用核质分离试剂盒进行核质分离实验。HEI-OC1细胞用预冷PBS清洗后，使用细胞刮刀收集。按照试剂盒说明书进行核质分离实验。

构建HBLV-mCherry-GFP-LC3B细胞系。HBLV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒购自汉恒生物科技（上海）有限公司。当HEI-OC1细胞密度达到30%-40%时，以感染复数（MOI）=10感染HBLV-mCherry-GFP-LC3B慢病毒。48小时后，HEI-OC1细胞在含有嘌呤霉素（5微克/毫升）的培养基中筛选至少48小时。当对照组中所有未经转染的细胞死亡后，病毒感染组中所有存活的细胞均为阳性。随后，建立了稳定表达mCherry-GFP-LC3B的细胞系。通过监测mCherry-GFP-LC3B表达评估自噬流。绿色荧光蛋白（GFP）在酸性环境中会被淬灭。当溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体时，GFP被淬灭，而mCherry保持稳定。黄色斑点（GFP⁺mCherry⁺）代表自噬体，红色斑点（GFP^?mCherry⁺）表示自噬体与溶酶体融合后形成的酸性自噬溶酶体（GFP信号被淬灭）。红色斑点数量的变化或红/黄斑点比率是自噬流的可靠指标。

进行药物处理。HEI-OC1细胞暴露于100 nM的自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）12或24小时，通过蛋白质印迹法评估自噬水平。此外，在细胞用100 nM的自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1，靶向自噬晚期阶段）处理12小时后测定自噬水平。

构建质粒和AAV2.7m8-Nmnat1病毒。由北京Tsingke生物技术公司生成重组腺相关病毒（AAV）载体pAAV-CMV-Nmnat1-EGFP质粒。通过与Lipofectamine 2000转染试剂共孵育将其转染到细胞中。由汉恒生物技术构建AAV2.7m8-Ctrl和AAV2.7m8-Nmnat1（含有pAAV-CMV-Nmnat1-3xFLAG-EF1-GdGreen-WPRE）。耳蜗外植体培养12小时后，用滴度为5 × 10¹⁰的AAV2.7m8-Ctrl和AAV2.7m8-Nmnat1感染36小时。随后，外植体暴露于D-gal 72小时，然后进行免疫荧光分析。

与广州EDITGENE公司合作，利用CRISPR/Cas9技术生成HEI-OC1-Nmnat1-KO细胞系。根据Nmnat1基因序列数据，在其开放阅读框5'端设计两个单向导RNA（sgRNA）：sgRNA 1：gaacagcctgaggtgcatgt 和 sgRNA 2：tgaggtgcatgttggtgatg。通过RT-qPCR和蛋白质印迹法验证Nmnat1敲除（KO）效率。使用CCTop-CRISPR/Cas9靶点在线预测网站预测sgRNA1和sgRNA2的脱靶位点。设计针对潜在脱靶位点的引物，并通过PCR和q-PCR验证脱靶效率。

与上海鹿明生物科技有限公司合作进行非靶向代谢组学分析。样品制备时，向样品中分两次加入1毫升混合溶剂（甲醇:水，体积比4:1），并转移至玻璃小瓶中。随后加入200微升氯仿，在冰水浴中进行超声处理（500 W；3分钟，超声6秒，间歇4秒）。将液体吸入离心管，在冰水浴中超声20分钟后，于-40°C储存过夜。样品在4°C、12,000 × g离心10分钟，收集400微升上清液，使用离心浓缩仪浓缩并干燥。然后加入80微升甲氧胺盐吡啶溶液（15毫克/毫升），在37°C孵育60分钟。随后在室温平衡30分钟。使用DB-5MS毛细管柱进行色谱分离。高纯度氦气（≥ 99.999%）作为载气，流速1.0毫升/分钟。进样口温度260°C；进样体积1微升，不分流进样；溶剂延迟5分钟。程序升温：初始柱温60°C（保持0.5分钟）；以8°C/分钟升至125°C；然后升至210°C，接着以15°C/分钟升至270°C；最后以20°C/分钟升至305°C（保持5分钟）。质谱检测使用电子轰击离子源，能量70 eV，离子源温度230°C，四极杆温度150°C。在全扫描模式下采集m/z 50-500范围内的数据。鉴定具有生物学意义的差异代谢物，并使用变量重要性投影（VIP）值和Student t检验评估组间差异的显著性。将p值 < 0.05且VIP > 1的代谢物视为存在显著差异。

使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。蛋白质印迹结果以均值±标准差（SD）表示，组间比较采用单样本t检验分析。免疫荧光染色结果以均值±标准误（SEM）表示。使用Student t检验比较γ-H2A.X聚集斑点和myosin7a⁺细胞数量。显著性判定阈值如下：*p < 0.05, p < 0.01,p < 0.001,***p < 0.0001，p值大于0.05认为无统计学意义。

3 结果

3.1 D-gal处理HEI-OC1细胞和耳蜗外植体衰老模型的建立

自然衰老是一个渐进的生理过程。为评估ARHL，通过用不同浓度D-gal（2、5、10、20和40毫克/毫升）处理HEI-OC1细胞72小时来建立衰老模型。CCK-8实验显示，随着D-gal浓度增加，HEI-OC1细胞活力逐渐降低。基于这些结果，使用低（5毫克/毫升）和高（20毫克/毫升）浓度的D-gal处理HEI-OC1细胞以确定ROS水平。MitoSOX和DCFH-DA的免疫荧光染色和流式细胞术表明，D-gal处理72小时后，HEI-OC1细胞中ROS水平升高。随后，检测了暴露于不同浓度D-gal的HEI-OC1细胞中衰老相关标志物SMP30、Lamin B1、γ-H2A.X、P21和P16的表达水平。在高浓度D-gal处理的HEI-OC1细胞中，SMP30和Lamin B1表达下调。然而，低浓度D-gal处理后，SMP30和Lamin B1的表达异常升高，表明低浓度D-gal可能激活了细胞自我保护机制。随着D-gal浓度增加，γ-H2A.X、P21和P16的表达逐渐显著升高。免疫荧光染色显示，D-gal处理的HEI-OC1细胞中γ-H2A.X聚集斑点数量显著增加，与蛋白质印迹结果一致。此外，SA-β-gal染色结果显示，D-gal处理的HEI-OC1细胞中细胞衰老明显增加。这些结果表明，用20毫克/毫升D-gal处理72小时可有效诱导HEI-OC1细胞衰老，为研究衰老提供了稳健的模型。

为建立耳蜗外植体衰老模型，从P3小鼠解剖出耳蜗基底膜并在体外培养。基于先前报道，耳蜗外植体暴露于不同浓度D-gal 72小时。对耳蜗外植体进行毛细胞标记物myosin7a的免疫荧光染色，结果显示低浓度D-gal（20毫克/毫升）组毛细胞数量无显著变化，表明低浓度未引起耳蜗毛细胞损失。然而，高浓度D-gal处理组中，顶转区域myosin7a⁺细胞数量无显著变化，但中转和底转区域显著减少，表明高浓度D-gal（40毫克/毫升）诱导了衰老表型并导致耳蜗毛细胞损伤。暴露于高浓度D-gal（40毫克/毫升）的耳蜗外植体中SMP30表达下调，而低浓度处理后其表达异常上调。随着D-gal浓度增加，Lamin B1表达水平降低，而γ-H2A.X、P21和P16的表达水平显著升高。此外，暴露于D-gal的耳蜗外植体中SA-β-gal染色强度显著上调。这些发现表明，暴露于40毫克/毫升D-gal 72小时可有效诱导体外耳蜗毛细胞衰老。D-gal处理的HEI-OC1细胞和耳蜗外植体衰老模型为研究衰老耳蜗毛细胞损伤机制和开发ARHL潜在治疗方法提供了有价值的框架。

3.2 衰老HEI-OC1细胞和耳蜗外植体中NMNAT1表达水平降低

老年小鼠耳蜗细胞中NAD⁺水平明显降低。此外，本研究发现在暴露于D-gal（20毫克/毫升）的HEI-OC1细胞中，NAD⁺水平显著降低。而且，在D-gal处理的耳蜗外植体衰老模型中，随着D-gal浓度增加，