AIE探针介导的凝血过程蛋白聚集体原位监测与抗凝剂高效筛选新策略

《Aggregate》：AIE-Mediated In Situ Monitoring of Protein Aggregates During Coagulation and Screening of Anticoagulant Agents

本文开发了一种基于聚集诱导发光（AIE）探针的无标记原位监测技术，结合生物传感靶向亲和筛选（BioSTAS）平台，实现了对凝血酶（thrombin）诱导的纤维蛋白（fibrin）聚集过程的动态可视化监测，并从复杂天然产物中高效筛选出两种新型抗凝活性单体（大黄酸rhein与齐墩果酸oleanolic acid）。该研究为蛋白聚集相关疾病研究及药物发现提供了创新性“检测-分离”一体化解决方案。

　　

1 引言

异常蛋白聚集是多种疾病的重要病理特征。在心血管疾病领域，凝血酶介导的纤维蛋白聚集是血栓形成的关键机制之一。天然产物是潜在抑制剂的宝贵来源，但其复杂成分对传统筛选方法构成挑战。研究团队前期建立的生物传感靶向亲和筛选（BioSTAS）技术，通过整合生物传感技术与亲和色谱技术，实现了复杂体系中活性成分的高效筛选。本研究聚焦于凝血过程中的关键蛋白——凝血酶和纤维蛋白原（fibrinogen）。当血管损伤激活凝血级联反应时，凝血酶会切割纤维蛋白原，使其转化为纤维蛋白单体，进而聚集成网，促进血栓形成。传统检测方法难以对凝血过程进行原位、动态可视化监测。近年来，具有“开启”式荧光响应机制的聚集诱导发光（AIE）分子在生物标记物检测中展现出显著优势。本研究旨在开发一种基于AIE探针的无标记原位监测技术，用于实时监测凝血酶诱导的凝血过程，并利用BioSTAS技术从天然产物中筛选抗凝活性成分。

2 结果与讨论

2.1 AIE分子（TTVP）的合成与计算

通过两步反应策略成功合成了AIE分子TTVP。密度泛函理论（DFT）计算显示，其HOMO-LUMO能隙为2.25488 eV，表明电子跃迁阻力较低。HOMO轨道的电子云主要集中在三苯胺部分，而LUMO轨道则延伸至吡啶侧链单元。相互作用区域指数（IRI）分析表明，TTVP分子系统内以吸引性相互作用为主。

2.2 生物聚集体介导的TTVP发光机制

在水-甘油体系中验证了TTVP的AIE特性：在100%水相中无荧光，随甘油比例增加，荧光显著增强。将TTVP引入凝血酶-纤维蛋白原反应体系后，生成的纤维蛋白聚集体呈现明显红色荧光，而TTVP的引入不影响纤维蛋白的正常聚集过程。分子动力学（MD）模拟表明，纤维蛋白聚合物的刚性结构为TTVP提供了稳定的结合位点，显著抑制了TTVP分子内三苯胺等可旋转键的运动（扭转角被限制在约30°的狭窄范围内），符合限制分子内运动（RIM）的AIE机制，从而导致荧光增强。

2.3 凝血酶活性的原位监测与评估

基于TTVP在聚集体中的发光特性，建立了凝血酶活性可视化的原位监测方法。该方法对凝血酶具有高特异性，其他测试蛋白、氨基酸、小分子化合物及蛋白酶均不能触发纤维蛋白聚集反应。分子对接模拟表明TTVP与纤维蛋白原结合极不稳定，其信号响应仅与凝血酶诱导的纤维蛋白原聚集过程相关。在25°C条件下，建立了凝血酶浓度（6.25–100 μg/mL）与聚集体面积之间的线性标准曲线（y = 63.8565x ? 41.7797, R²= 0.9979）。利用临床常用凝血酶抑制剂阿加曲班（argatroban）作为阳性对照验证了检测系统的有效性，其抑制效果呈浓度依赖性，而阴性药物则无影响。

2.4 凝血酶@碳纳米管（Thrombin@CNTs）介导的亲和靶向筛选评估

以碳纳米管（CNTs）为载体，通过EDC/NHS交联法制备了固定化凝血酶（Thrombin@CNTs）。酶活性回收率为33.27%。透射电镜（TEM）显示固定化前后形貌无明显变化。X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析证实了凝血酶通过酰胺键成功固定在CNTs上。高效液相色谱（HPLC）评估显示，Thrombin@CNTs对抑制剂阿加曲班的吸附率高达82%，而对无活性阴性药物的吸附率低于10%，表明该亲和色谱模型具有良好的选择性和准确性。

2.5 复杂体系中抑制剂的筛选

利用建立的凝血酶活性原位监测系统，对34种中药及复方制剂提取物进行了抑制活性筛选。结果表明，大黄提取物和“甘西乐”胶囊提取物能完全抑制纤维蛋白聚集物的形成，提示其中含有强效的凝血酶抑制剂。

2.6 抑制剂的分离与鉴定

利用Thrombin@CNTs亲和色谱模型，从“甘西乐”胶囊提取物中特异性捕获并鉴定出活性单体为齐墩果酸（oleanolic acid）。从大黄（Rhei Radix et Rhizoma）提取物中捕获并鉴定出四种成分：芦荟大黄素（aloe-emodin）、大黄酸（rhein）、大黄素（emodin）和大黄酚（chrysophanol）。活性验证表明，仅大黄酸和齐墩果酸对凝血酶具有显著抑制活性，其半数抑制浓度（IC₅₀）值分别为308.2 μM和312.2 μM。作为对比，阳性药比伐卢定（bivalirudin）和阿加曲班的IC₅₀值分别为8.62 μM和2.71 μM。

2.7 分子对接与分子动力学模拟

分子对接显示，大黄酸主要与凝血酶的GLY-219、TYR-228和SER-214等残基相互作用，而齐墩果酸则与ASP-189、ALA-190、VAL-213和CYS-220等残基结合。100 ns分子动力学模拟表明，两种复合物的均方根偏差（RMSD）值分别稳定在3 ?和4 ?左右，均方根涨落（RMSF）分析显示残基波动幅度小，表明复合物体系构象稳定。氢键时间线分析进一步揭示了大黄酸与ASP-189、ALA-190、GLY-219之间，以及齐墩果酸与LYS-60、ALA-190之间能形成持续稳定的氢键相互作用。

3 结论

本研究成功将AIE探针应用于凝血系统的无标记原位监测，建立了基于BioSTAS技术的抗凝剂筛选新方法，并从30余种复杂体系中筛选出两种具有抗凝活性的先导化合物。该技术为其他靶点抑制剂的筛选及AIE探针的应用拓展提供了新思路。