《Aging Cell》：Synaptic Vesicle Glycoprotein 2A Suppresses Amyloidogenesis Beyond Its Synaptic Role: A Novel Mechanism Disrupting BACE1 Binding and Altering APP Localization
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本研究发现，突触囊泡糖蛋白2A（SV2A）不仅是阿尔茨海默病（AD）中突触丢失的标志物，更作为淀粉样前体蛋白（APP）的新型结合蛋白，通过抑制APP与β-位点APP裂解酶1（BACE1）的结合，并改变APP在细胞内体-溶酶体系统中的分布，从而显著减少Aβ斑块沉积。该研究揭示了SV2A在APP代谢中的关键调控作用，为AD的早期干预提供了新的潜在治疗靶点。
1 引言
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种典型的进行性神经退行性疾病，其特征性神经病理学改变包括老年斑沉积、神经纤维缠结、突触和神经元丢失。研究表明，老年斑主要由β-淀粉样蛋白（Aβ）肽组成，该肽是由淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）依次经β-位点APP裂解酶1（BACE1）和γ-分泌酶切割产生。脑内Aβ的聚集被认为是AD的关键起始事件，其具有强毒性，可激活小胶质细胞、诱导神经炎症反应、引起神经毒性作用，最终导致一系列AD病理表现。
APP是Aβ的前体物质，是一种高度表达于神经元树突和轴突的I型跨膜蛋白。APP的降解方式主要分为淀粉样代谢途径和非淀粉样降解途径，直接影响AD的进程。APP的结合蛋白是影响其降解的关键因素。
突触囊泡糖蛋白2A（Synaptic vesicle glycoprotein 2A, SV2A）是突触囊泡糖蛋白2（SV2）家族的重要成员，主要存在于突触囊泡上，在海马、皮层和小脑的兴奋性和抑制性神经元中广泛表达，在突触囊泡循环和调节动作电位依赖性神经递质释放中起重要作用。近期多项研究发现，SV2A正电子发射断层扫描（PET）成像可作为突触变性和AD病理的生物标志物，揭示了SV2A在AD进展中的作用。然而，SV2A与APP以及Aβ之间的详细分子机制尚未阐明。
2 材料与方法
本研究纳入了112名受试者的脑脊液（CSF）标本和358名受试者的血清标本。AD模型采用过表达突变型家族性AD基因（APP/presenilin-1-dE9, APP/PS1）的转基因小鼠。通过脑立体定向注射技术注射腺相关病毒（AAV）构建SV2A过表达的APP/PS1小鼠。在体内外实验中，采用蛋白质印迹（Western blotting）、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光、硫磺素S（Thioflavin S）染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、双分子荧光互补（BiFC） assay、细胞表面生物素化 assay等方法，探讨SV2A对APP降解的影响及其分子机制。行为学测试包括新物体识别（NOR）和莫里斯水迷宫（MWM）测试。
3 结果
3.1 SV2A减轻了APP/PS1小鼠脑区淀粉样斑块负荷
硫磺素S染色结果显示，与对照组相比，SV2A过表达的APP/PS1小鼠海马和皮层区域的Aβ斑块沉积显著减少，Aβ斑块的数量、大小和面积均显著降低。免疫荧光染色6E10（一种Aβ标志物）进一步证实，SV2A过表达显著降低了APP/PS1小鼠海马和皮层区域Aβ斑块的数量、大小以及6E10抗体染色强度。
3.2 SV2A在体内外抑制APP的淀粉样代谢
在APP/PS1小鼠的脑组织（海马和皮层）和血清中，SV2A过表达显著降低了Aβ40、Aβ42和可溶性APPβ（sAPPβ）的水平，而对可溶性APPα（sAPPα）水平无显著影响。在体外培养的原代海马神经元和SH-SY5Y-APP细胞中，SV2A过表达同样显著降低了细胞上清液中Aβ40、Aβ42和sAPPβ的水平，而不影响sAPPα的水平。这些结果表明SV2A特异性抑制APP的淀粉样代谢途径，而非非淀粉样降解途径。
3.3 SV2A被鉴定为APP的结合蛋白
免疫荧光实验显示，SV2A与APP在HT22细胞、原代海马神经元以及APP/PS1小鼠皮层组织中存在显著共定位。免疫共沉淀实验进一步证实，在野生型（WT）和APP/PS1小鼠的皮层组织中，SV2A可被抗APP抗体免疫沉淀，APP也可被抗SV2A抗体免疫沉淀，表明SV2A是APP的结合蛋白。
3.4 SV2A抑制BACE1与APP的结合
作为APP淀粉样代谢途径的第一个裂解酶，BACE1与APP的结合是启动APP淀粉样降解的关键环节。免疫荧光实验显示，在过表达SV2A的SH-SY5Y细胞和N2a细胞中，BACE1与APP的共定位程度降低，Manders重叠系数（MOC）显著减小。双分子荧光互补（BiFC）实验直接检测APP与BACE1的结合能力，结果显示，在SV2A过表达的SH-SY5Y细胞中，Venus荧光的积分面积和百分比面积均显著降低，表明APP与BACE1的结合能力减弱。在APP/PS1小鼠海马组织中，SV2A过表达同样降低了BACE1与APP的共定位，Pearson相关系数（PCC）和MOC均显著降低。
3.5 SV2A减少了APP在内体-溶酶体系统中的定位
APP的分布对其淀粉样裂解至关重要。蛋白质印迹分析显示，在SV2A过表达的SH-SY5Y细胞和N2a细胞中，早期内体标志物EEA1、晚期内体标志物Rab7和溶酶体标志物LAMP1的水平及其相对表达量显著降低，而循环内体标志物Rab11的水平显著增加。免疫荧光共定位分析进一步证实，SV2A过表达降低了APP与EEA1、Rab7、LAMP1的共定位（MOC减小），但增加了APP与Rab11的共定位（MOC增加）。细胞表面生物素化实验和免疫荧光结果显示，SV2A过表达增加了SH-SY5Y细胞表面的APP水平。在APP/PS1小鼠的海马和皮层区域，SV2A过表达也显著增加了细胞表面的APP荧光强度。这些结果表明，SV2A抑制APP在早期内体、晚期内体和溶酶体中的定位，但促进其向循环内体和细胞膜分布。
4 讨论
本研究通过体内外实验揭示了SV2A在AD病理进展中的作用。首先，SV2A过表达减少了APP在早期内体、晚期内体和溶酶体中的分布，同时增加了其在循环内体和细胞膜上的分布。此外，作为APP的结合蛋白，SV2A过表达抑制了BACE1与APP在内体-溶酶体网络中的结合。通过这些机制，SV2A过表达抑制了APP的淀粉样降解途径，最终导致Aβ蛋白和淀粉样斑块的减少。
SV2A主要位于外周交感神经突触和突触前囊泡末端，被公认为反映脑内突触密度的首个生物标志物。本研究发现AD患者死后海马和皮层、以及轻度认知障碍（aMCI）和AD患者的脑脊液和血清中SV2A水平显著降低，且其水平与认知评分显著相关，表明SV2A参与AD的发生发展。行为学测试表明，SV2A上调可显著改善AD模型小鼠的认知功能，其机制可能与减少Aβ斑块沉积有关。
Aβ通过APP的淀粉样降解途径产生。本研究结果表明，SV2A特异性抑制APP的淀粉样降解途径，而对非淀粉样降解途径无影响，这很好地解释了SV2A过表达减少APP/PS1小鼠脑内Aβ斑块的原因。
APP的结合蛋白是影响其降解的关键因素之一。本研究通过GST-pulldown联合质谱分析初步筛选了APP的结合蛋白，并在细胞和小鼠脑组织中证实了SV2A与APP的相互作用。考虑到SV2A结合可能诱导APP构象变化，本研究进一步探讨了其对BACE1与APP诱导契合的影响。结果表明，SV2A过表达显著降低了APP和BACE1在细胞和小鼠海马组织中的共定位程度，BiFC实验直接证明SV2A削弱了APP与BACE1的结合能力。
APP在细胞内外的分布是其淀粉样裂解的关键决定因素。内吞后，细胞表面的APP被运至早期内体，随后分选进入不同途径：一部分APP被靶向至晚期内体，与溶酶体融合后降解；未降解的APP通过循环途径回收至细胞膜。内体-溶酶体网络，尤其是早期内体和晚期内体，是APP发生淀粉样降解的主要场所。SV2A在囊泡运输和胞吐、神经递质转运和释放以及调节钙敏感性中起关键作用。本研究发现，SV2A抑制了早期内体、晚期内体的形成以及APP在其中的定位，从而减少了APP的β-裂解，进而降低了Aβ的产生。与早期内体、晚期内体和溶酶体中的结果相反，SV2A促进了循环内体的水平及其与APP的共定位，以及APP在细胞表面的分布。综上所述，SV2A抑制APP在内体-溶酶体系统中的定位，并促进其循环至细胞膜，从而抑制APP在内体中的淀粉样降解。
本研究表明，SV2A通过下调APP的淀粉样降解来抑制AD的病理进展。作为APP的结合蛋白，SV2A通过抑制BACE1与APP的结合并调节APP在细胞膜和内体-溶酶体网络中的分布来减少APP的淀粉样途径。因此，SV2A有望成为未来AD早期干预的潜在靶点。
