《Cell Proliferation》：Vascularised Brain Organoids: Engineering Strategies and Neurobiological Applications
血管化脑类器官：工程策略与神经生物学应用
摘要
脑类器官已成为研究人类神经发育和神经系统疾病的重要平台。然而，传统脑类器官的一个主要限制是缺乏血管结构。这种缺陷限制了类器官的尺寸，导致坏死核心的形成，并阻碍了其功能成熟。引入血管化提供了一个引人注目的解决方案——它增强了营养输送，支持神经发生，并促进了类似血脑屏障（BBB）界面的发展。本综述探讨了血管化如何增强脑类器官的结构和生理相关性，及其在疾病建模和治疗筛选中日益增长的重要性。
1 引言
随着干细胞研究的进展，其分化为多种细胞类型并自组织成类组织结构的能力引起了广泛关注。基于这些能力，科学家们已成功在三维环境中培养干细胞，创造出与真实器官结构和功能高度相似的类器官。特别是，使用人诱导多能干细胞（hiPSC）和胚胎干细胞（ESC）的研究已积极培育出大脑、胰腺、肝脏和肾脏等多种器官的类器官。这些类器官相比传统的二维细胞培养提供了更具生理相关性的研究模型。
脑类器官，这种源自多能干细胞的体外三维模型，显著提升了我们在生理相关框架内复制早期人脑发育和研究神经系统疾病的能力。这些类器官能自发组织成类似发育中皮层的分层结构，并部分捕获了脑细胞类型的多样性和架构。尽管有这些优势，传统的脑类器官面临着关键挑战，包括坏死核心的形成、生长受限和功能成熟受损——这些问题很大程度上归因于血管网络的缺失。
新兴的血管化技术为解决这些缺陷提供了有前景的途径。各种方法已被探索用于增强营养和氧气输送并促进成熟，例如与内皮细胞（EC）共培养、血管转录因子如Ets变体2（ETV2）的异位表达、移植到宿主动物体内，以及与先进的微流体平台整合。然而，这些方法各有其局限性，例如不完全的BBB形成、有限的长期稳定性或可重复性方面的挑战。这些挑战凸显了需要结合多种技术（如生物工程、基因编辑和微流体系统）的整合策略，以克服当前限制并进一步推进脑类器官的血管化。
尽管血管化技术取得了显著进展，但其实际效用和可扩展性因不同的工程策略而异。体内移植能产生最生理成熟且可灌注的血管系统，但其对动物宿主的依赖性、有限的通量和批次间差异性限制了其在药物发现或患者特异性筛选中的广泛应用。相比之下，微流体灌注系统和基于3D生物打印的可灌注支架能够在完全体外环境中实现精确控制的流动、剪切应力和长期组织活力，提供了卓越的可重复性和可扩展性。
对于以疾病为重点的应用，我们强调卒中、胶质母细胞瘤和阿尔茨海默病作为代表性模型，因为这些疾病表现出明确的神经血管功能障碍——如缺血性缺氧、肿瘤驱动的血管生成和BBB破坏——vBOs能够稳健地重现这些表型。
2 血管化在脑类器官中的重要性及功能效应
人脑是代谢需求最高的器官之一，依赖于复杂的血管网络进行持续的养分和氧气输送、废物清除以及BBB的维持。传统的脑类器官虽然在模拟人类神经发育和疾病方面具有革命性意义，但本身缺乏血管系统。这种缺失导致核心区域缺氧诱导的坏死、神经组织成熟受限，以及缺乏生理相关的神经血管相互作用。
将血管化引入脑类器官为这些挑战提供了强有力的解决方案。与EC共培养或基因诱导血管网络等策略显著增强了氧气可用性、细胞活力和长期培养的稳定性。与未血管化的对应物相比，vBOs表现出改善的神经元成熟、空间模式化和突触功能。血管化在部分重建BBB——一个调节分子交换和中枢神经系统稳态的关键界面——方面也起着关键作用。具有灌注血管和紧密连接形成的vBOs表达关键的BBB相关蛋白，如ZO-1、occludin和claudin-5，并表现出类似于体内条件的选择性通透性。这些特征使vBOs在中枢神经系统药物筛选中极具价值，可提供更具人类相关性的药物通透性和神经毒性评估。
此外，血管微环境主动调节神经干细胞动力学。ECs分泌信号分子，如VEGF、BDNF和Wnt，这些分子影响神经祖细胞的增殖、迁移和区域特异性分化。这使得能够形成不同的大脑区域——如皮层样或海马样结构——增强了类器官的发育保真度。
血管的存在还支持神经元和胶质细胞之间的代谢耦合。通过促进葡萄糖和乳酸的运输，vBOs维持了长时间的神经元活动和能量稳态。此外，改善的灌注有助于电生理成熟，表现为自发放电增加、突触可塑性增强和更稳健的神经网络活动——这些特征对于模拟神经退行性和神经发育障碍至关重要。
重要的是，血管化改善了脑类器官的结构和机械完整性。通过促进细胞外基质重塑和组织刚度，血管增强了类器官在长期培养过程中的韧性。此外，血管元素为自组织和干细胞维持提供了指导性线索，有助于形成更一致的类器官结构。vBOs还允许包含免疫细胞，如小胶质细胞或外周白细胞。这使得能够模拟与阿尔茨海默病、多发性硬化症、病毒性脑炎和脑肿瘤相关的神经免疫相互作用。
3 在脑类器官中实现血管化的策略
3.1 与内皮细胞共培养
将血管特征引入脑类器官最广泛采用的策略之一是与ECs共培养。这种方法涉及在类器官发育的早期或中期阶段，将来源于原代、永生化或iPSC的ECs整合到类器官培养物中。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）因其可及性和强大的血管生成能力而被常用。或者，iPSC来源的ECs更具生理相关性，并提供患者特异性来源。在合适的条件下共培养时，这些ECs可以在类器官内自组织成血管样网络，有时形成管腔结构并表达EC标志物如CD31、VCAM-1和血管性血友病因子。常与来自不同来源的间充质干细胞共培养。脂肪组织来源的MSC和骨髓来源的MSC是常见的与HUVEC共培养用于各种靶组织血管生成的MSC。
共培养促进了内皮细胞整合到类器官基质中，促进了营养交换，并支持了神经元存活。在某些情况下，ECs分泌的营养因子进一步影响神经发生和胶质细胞成熟。尽管有这些优势，挑战仍然存在。共培养形成的血管网络通常不可灌注，并且由于缺乏周细胞覆盖或足够的基底膜，生理保真度有限。此外，血管形成是自组织的，导致类器官间在血管分布、位置和模式上存在异质性。由于这些特点，对血管组织的空间控制通常较低。而且，尽管ECs的存在可能部分模拟BBB的某些方面，但这些系统中的完整BBB功能仍然有限。
尽管如此，共培养方法将血管元件引入脑类器官，实现了脑细胞和血管细胞之间的直接相互作用。这不仅促进了改善的营养和氧气交换，还支持了神经血管信号传导，模拟了体内微环境的关键方面。由于其相对简单、成本效益高以及与现有类器官方案的兼容性，共培养仍然是最易获得和可扩展的策略。此外，它作为一个宝贵的基础平台，用于整合其他组件——如周细胞、星形胶质细胞或生物工程支架——以构建更具生理准确性和功能性的脑模型。
3.2 血管化基因工程
基因工程方法已被用于诱导脑类器官内的内源性血管化，而无需外部内皮细胞共培养。该策略通常涉及异位表达促进内皮命运的关键转录因子或信号分子，例如血管发育的主调控因子ETV2。最近的研究表明，将ETV2与其他血管调节因子如SOX17或VEGF-A结合可以增强内皮成熟和功能整合，更紧密地模拟血管化的逐步过程。
与共培养方法相比，基因诱导的血管化可能导致血管在整个类器官中分布更均匀，因为血管祖细胞在发育早期内源性产生。这种方法还允许通过诱导型启动子或CRISPR激活系统对血管诱导进行时空控制。尽管内皮特性的诱导是均匀的，但血管结构的空间模式化仍然控制不佳，通常导致非生理性或随机分布的血管网络。
然而，这种方法有局限性。在ETV2诱导过程中，具有内皮细胞特征的细胞排列成血管状形成管状结构，但该结构内没有血液流动。因此，无法执行真实血管的功能，如氧气和营养供应以及废物清除。因此，ETV2过表达产生的血管通常缺乏对成熟EC完全功能特性的反应，如选择性通透性、紧密连接形成和对剪切应力的反应。此外，在静态培养系统中，缺乏血流或灌注压力会干扰工程血管的成熟和稳定。
为了进一步提高ETV2基于策略的技术稳健性，系统量化这些类器官中的内皮分化效率和血管功能将非常重要。尽管有这些进展，大多数ETV2诱导的vBO研究仍然在很大程度上依赖于标志物表达，而不是定量指标，如网络覆盖率、EC纯度或管腔形成效率。在常规内皮和器官芯片平台中广泛使用的功能血管测定——包括管形成分析、跨内皮电阻测量和荧光示踪剂通透性测试——在ETV2工程类器官中仍然很少应用。然而，已建立的EC和BBB模型文献强调这些测定的重要性。
工程血管网络另一个重要但尚未充分探索的方面是动静脉特化。当前基于ETV2或转录因子的血管化方法主要产生通用的内皮管，没有清晰分离为动脉、静脉或毛细血管样特征。然而，动静脉命运受明确的发育信号通路调控。这些通路的缺失可能会限制它们重现生理血流动力学、剪切应力梯度或对缺氧或炎症损伤的区域特异性易感性的能力。因此，将转录因子编程与生物力学刺激、动静脉特异性报告基因或微流体流动系统整合，代表了在脑类器官内重建层次化血管树的一个有前景的途径。
尽管有这些缺点，基因工程提供了一个强大的集成血管化平台，特别是与微流体灌注系统或体内移植相结合时。合成生物学和基因编辑的未来进展可能会进一步提高该策略的准确性和效力。
3.3 基于灌注的血管化
基于灌注的策略旨在通过整合微流体流动系统或工程化的可灌注通道来模拟血管网络，从而克服脑类器官中氧气、营养物质和代谢废物固有的扩散限制。这些策略促进了可溶性因子在类器官核心深处的交换，从而减少了在非血管化静态培养中通常出现的缺氧和坏死区域。与主要关注细胞水平血管模拟的共培养或基因工程方法不同，基于灌注的方法提供了生理相关的生物力学线索——最显著的是剪切应力——这对ECs的分化、极化和长期功能至关重要。
微流体装置是一种密集形成精细通道的机械装置，允许精确控制灌注。在一项研究中，微流体装置与脑类器官集成以模拟血液灌注，实现培养基持续流动。这些系统支持长期培养，通过维持氧气梯度并促进废物清除，从而促进更大、更具生理相关性的类器官的生长。例如，Wang等人设计了一个与脑类器官室相连的灌注BBB芯片，改善了屏障完整性和内皮形态。
另一种策略是通过生物打印可灌注通道或插入后续可移除的牺牲性水凝胶来创建中空血管。这些人工通道可以内衬ECs或涂覆ECM以增强相容性并实现血管浸润。与脑类器官结合，这些系统已被证明可以平滑供应氧气和营养物质，从而增强细胞活力，减少缺氧，并实现更有组织的神经分化。这导致了更复杂和真实的神经网络。
基于灌注的方法还能够实现类器官内部环境的实时监测和访问，用于药物递送研究或疾病建模。然而，这些方法的实施在技术上很复杂，需要精确控制专用设备和流动动力学。尽管如此，基于灌注的策略不仅减轻了扩散限制，还提供了对血管成熟至关重要的机械刺激。通过实现剪切应力和对流运输，它们防止了缺氧核心的形成，并增强了内皮和神经发育。这些系统还提供实时监测和精确的环境控制，使其成为疾病建模和药物筛选的有前景的平台，尽管存在技术需求。
3.4 基于体内移植的血管化
体内移植提供了一个强大的策略，利用宿主的天然血管来实现脑类器官的功能性血管化。当移植到免疫缺陷小鼠体内时，脑类器官可以迅速被宿主来源的ECs血管化，这些ECs可以穿透类器官形成具有管腔的血管。这些血管与体循环相连，提供必需的氧气和营养物质，改善类器官的存活和生长。使用非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷IL-2Rγ无效小鼠等免疫缺陷小鼠模型可以防止异种移植排斥，并促进人类类器官的长期植入而无免疫介导的干扰。
体内移植不仅提供血管整合，还将类器官暴露于其他宿主来源的生理线索，如炎症信号、机械力和神经活动，这可以进一步影响神经发育、胶质生成和回路形成。此外，浸润类器官的宿主来源的ECs可以开始表达紧密连接蛋白和其他与BBB相关的标志物，为研究体内人BBB发育和功能提供了一个独特的平台。
这种方法首先由Mansour等人证明，他们将人脑类器官植入小鼠皮层，并在几周内观察到宿主来源的CD31阳性血管深入类器官结构。血管化的类器官与未移植的对照组相比，显示出坏死减少、神经元成熟改善和轴突生长。宿主血管的功能整合已通过灌注荧光葡聚糖或氧敏感染料得到验证，证实类器官内新形成的血管能够进行活跃的血流和氧气输送。
除了被动整合外，类器官与ECs或MSCs的共同移植已被证明可以增强血管发育并支持神经发生。此外，移植到血管丰富的区域，如蛛网膜下腔或纹状体，可以改善移植物的存活和整合。重要的是，体内模型为研究血管-器官相互作用、BBB形成和长程神经投射提供了在生理相关环境中进行的机会。尽管有这些优势，人类类器官细胞与鼠类宿主血管系统之间的物种差异可能引入分子信号传导的变异性，可能影响人类特异性发育过程的保真度。此外，该方法存在伦理问题，由于动物模型的要求而限制了可及性，并且对高通量筛选或患者特异性研究提出了挑战。颅窗技术和活体成像等最新进展允许对移植的类器官进行实时监测，从而能够动态评估血管整合、神经元活动和随时间的疾病进展。
3.5 混合方法
混合策略旨在结合多种血管化技术的优势，以克服单个方法固有的局限性。这些方法整合了共培养、基因工程、灌注和体内移植的各个方面，以创建更成熟、功能更全面且可扩展的vBOs。
例如，Cakir等人将ETV2诱导的内皮编程与体内移植相结合，以增强脑类器官中的血管整合和成熟。表达ETV2的细胞在体外形成血管样网络，移植后与宿主血管连接，以改善氧气扩散并支持神经发育。此外，血液流动允许氧气供应和废物清除，补偿了仅靠ETV2基因操作无法获得的效果。
其他方法整合了动态灌注和共培养系统。微流体灌注系统已与共培养的内皮细胞和周细胞结合使用，以实现同时的动态流动和细胞间相互作用。这些系统比静态培养更准确地重现BBB特性，并实现实时药物测试。在一项使用PREDICT96平台的高通量微血管共培养模型的研究中，将人视网膜微血管EC和周细胞在微孔膜的两侧培养构建了共培养模型。该系统包含96个双层微流体装置，每个都可以独立控制流体流动，允许同时评估各种实验条件。与单一培养相比，共培养改善了屏障功能，并增加了对炎症刺激和流体剪切应力的反应性。
一些研究人员采用生物打印支架作为混合策略。这些接种了经过基因改造或预分化的ECs的支架可以植入体内，以促进与宿主血管的快速吻合。这种方法利用了宿主系统的自然重塑能力，同时提供了空间可控的血管模板。一项研究中，将ECs和成纤维细胞接种到胶原支架中以诱导预血管化。这些支架在体内的移植显示与宿主组织的快速整合和血管化，这被认为是组织工程应用的有用策略。混合策略的一个主要优势是包含多种支持细胞类型——包括周细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和免疫细胞——这更忠实地复制了复杂的神经血管微环境。这些细胞在血管稳定性、BBB完整性和神经组织稳态中起着重要作用，实现了更具生理相关性的细胞间通讯。通过结合不同的血管化方法，混合系统促进了长期血管稳定性和成熟，改善了氧气和营养输送以及神经发生、胶质生成和神经回路形成所必需的血管信号传导。基因工程提供的空间和时间精度，与灌注的机械刺激和体内移植的生理条件相结合，解决了单一技术的关键限制。
混合模型在精准医疗中也显示出巨大潜力。患者来源的干细胞和基因编辑的整合允许产生个性化的脑类器官，促进对阿尔茨海默病、卒中和脑肿瘤等神经系统疾病的疾病建模。这些类器官为靶向治疗筛选提供了平台，并更好地代表了患者特异性表型。
然而，混合策略在技术上很复杂，需要干细胞生物学、组织工程、微流体和动物手术方面的跨学科专业知识。伦理考虑，特别是关于人-动物嵌合体的伦理，也必须仔细权衡。此外，标准化和可扩展性仍然是临床和药物转化的重要障碍。展望未来，与新兴技术（如人工智能驱动的培养优化、使用仿生材料的先进3D生物打印和实时生物传感器监测）的整合可能会进一步完善混合策略。这些进步可以实现功能化vBOs的高通量、可重复生产，彻底改变人类大脑发育、神经血管疾病和药物递送平台的体外建模。
4 血管化脑类器官的应用
4.1 神经系统疾病建模
vBOs为模拟与神经血管功能障碍相关的复杂神经系统疾病（如卒中、阿尔茨海默病和血管性痴呆）提供了一个强大的平台。血管网络的整合使得能够模拟缺氧或缺血状态，促进对神经元损伤、血管生成和缺血后修复的机制研究。
最近的研究使用血管化脑类器官来模拟缺氧缺血性损伤，利用共培养或组装体方法将中胚层来源的血管类球体整合到皮层类器官中，以产生可灌注的NVU样结构。HI损伤是新生儿脑病的主要原因。在最近的工作中，中胚层来源的血管类器官与外胚层来源的脑类器官融合，创建了融合的血管化脑类器官。类似的神经血管组装体平台已被证明支持周细胞募集、星形胶质细胞-内皮细胞串扰和葡聚糖可灌注血管形成，强调了它们适用于模拟缺血诱导的BBB功能障碍。这些类器官在缺氧条件下表现出比非血管化类器官更广泛的反应，神经发育相关基因的表达显著减少。此外，血管结构似乎保护了T-box脑蛋白2阳性中间祖细胞，表明血管有助于神经保护。
在一项研究中，使用人诱导多能干细胞来源的脑类器官建立了缺氧卒中模型。卒中是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因之一，其发病机制和机制尚未完全明了。该模型成功重现了缺血损伤后的神经元细胞死亡、炎症反应和血管功能障碍。观察到三种星形胶质细胞亚型的显著增加，每种对缺氧条件表现出不同的反应。此外，还确定了在缺血大脑中负责促进脑组织增殖的主要星形胶质细胞亚型。在体内和体外条件下，皮层兴奋性神经元在缺氧后表现出凋亡和衰老迹象。通过将脑类器官与多组学分析结合使用，该研究能够精确研究缺氧脑损伤的潜在机制。这些发现与对血管化类器官技术的更广泛调查一致，其中卒中和缺血性脑病是主要用例，需要控制血管重塑和氧气梯度作为关键读数。
在阿尔茨海默病中，血管化类器官支持对Aβ积累、tau蛋白过度磷酸化和BBB破坏的研究，并在更具生理相关性的背景下进行。此外，这些类器官可用于研究长期神经退行性过程，更忠实地捕捉疾病进展。它们还提供了一种探索神经炎症和免疫细胞浸润的方法，为多发性硬化症和血管性认知障碍等疾病提供了见解。
最近一项研究开发了源自hPSC的血管化神经免疫类器官。这些类器官包含与阿尔茨海默病相关的关键细胞类型，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管结构。值得注意的是，当将散发性阿尔茨海默病患者的脑提取物应用于类器官时，在四周内重现了标志性的病理特征，如Aβ斑块形成、tau病理、神经炎症、突触丧失和神经网络功能受损。此外，用FDA批准的药物lecanemab治疗导致Aβ积累减少和血管炎症反应增加，在模型中证明了治疗效果。这些研究共同将血管化和神经免疫脑类器官定位为模拟散发性和遗传复杂性神经退行性疾病的下一代平台，能够同时评估对患者特异性损伤或治疗性抗体的神经元、胶质和血管表型。
4.2 药物通透性与BBB药物递送测试
vBOs最有前景的应用之一是药物筛选和BBB通透性测试。与传统的2D或非血管化模型相比，这些类器官更准确地复制了人BBB的选择性通透性和紧密连接特性，使其成为评估CNS药物递送的理想选择。
在这项研究中，通过共培养人源脑EC、周细胞和星形胶质细胞构建了三维BBB类球体。这些类球体表达紧密连接蛋白和药物转运蛋白，有效地模拟了BBB的选择性通透性。使用荧光标记的葡聚糖和候选药物化合物评估了药物对类球体的渗透。特别是，验证了Angiopep-2等BBB穿透肽的渗透增强作用。这些类球体以96孔板形式生成，证明了它们作为高通量药物筛选平台的潜力。因此，这些血管化类球体成功复制了BBB的关键特征，并被用于评估跨屏障的药物通透性。
与微流体系统集成允许实时动态测试化合物渗透、外排活性和毒性。这对于评估P-糖蛋白介导的药物外排特别有用，这会影响药物在脑中的滞留。在这项研究中，通过融合hPSC来源的脑类器官和血管类器官生成了血管化BBB组装体。免疫荧光染色显示组装体内ECs中BBB特异性标志物如GLUT1、ZO-1和claudin-5的表达。这些特征反映了人BBB的紧密连接形成和选择性通透性。此外，观察到星形胶质细胞终足和周细胞过程包裹内皮管，通过TEER进行的功能评估证实了低通透性，模拟了体内BBB功能。单细胞和空间转录组学进一步证明了主要NVU细胞类型的存在及其空间组织。通过使用来自患有脑 cavernous 血管畸形突变患者的iPSC衍生的组装体，该研究还重现了CCMs的病理生理特征，包括紧密连接破坏和异常血管形态。这些发现突出了人BBB组装体作为模拟神经血管相互作用、研究脑血管疾病和开发CNS靶向疗法的稳健平台的实用性。
此外，血管化类器官与高通量筛选平台兼容，可用于评估纳米医学策略，如脂质体或外泌体，这些策略旨在增强BBB运输和位点特异性药物靶向。在这项研究中，使用六种主要人脑细胞类型构建了三维脑类球体。该类球体重现了BBB的关键特征，并用于评估荧光标记的2纳米金纳米颗粒的BBB通透性。基于最初观察到的超小纳米颗粒可以穿透细胞膜并进入细胞核，该研究证明这些纳米颗粒可以穿过BBB并积累在类器官的核心。这一发现表明超小金纳米颗粒可以有效地穿过BBB并被递送到脑组织深处，为开发针对脑疾病的药物递送系统提供了宝贵的基础。此外，在缺氧条件下观察到的BBB通透性增加为卒中等等缺血性疾病的药物递送策略提供了有用的见解，并支持该模型用于评估基于纳米医学的治疗方法的功效。
4.3 细胞治疗与再生医学
vBOs在再生医学和细胞治疗领域前景广阔，其中血运重建对于移植物存活和整合至关重要。移植预血管化的类器官可以通过快速连接到宿主血管并改善氧气和营养输送，来修复由创伤、卒中或神经退行性变引起的脑损伤。
在这项研究中，将hPSC来源的脑类器官移植到经历过光血栓性卒中的NOD-SCID小鼠的梗死核心和梗死周围区域之间的连接处。移植的类器官存活下来，分化为神经元，并有助于受损组织的修复。使用人脑类器官移植的类似卒中修复范例已经证明，病变边界处的血管向内生长与移植物存活和宿主组织保留紧密相关，突出了将类器官放置在血管生成线索最强的梗死周围界面的重要性。它们还将轴突延伸到遥远的脑区域，整合到宿主神经回路中。这种整合与感觉运动功能的恢复有关。
创伤性脑损伤最近已成为一个关键适应症，其中vBOs可能优于传统的细胞悬液，因为弥漫性轴索损伤和慢性低灌注既需要神经元替换，也需要快速的血管支持。在这项研究中，将血管化脑类器官移植到TBI小鼠模型中以评估其治疗潜力。脑类器官由hPSC产生，并与来自人脐静脉的内皮细胞共培养，以诱导类器官内形成管状血管结构。移植后，类器官成功与宿主血管系统整合，并表现出改善的存活率和神经元活性。免疫染色和行为评估显示，移植的类器官有助于神经回路重建并增强认知功能，如学习和记忆。这项研究强调了优化CNS类器官的血管化和成熟以改善治疗结果的重要性，并提出整合生物工程方法（如模拟血流的微流体系统）可能会进一步增强体内血管网络的形成和功能整合。事实上，最近的微流体预处理研究表明，在植入前将血管化类器官暴露于受控的剪切应力可增强血管稳定性，并可能促进移植后更快的吻合。
在这项研究中，将人胚胎干细胞来源的脑类器官移植到新生小鼠的病变皮层中，以评估其神经修复潜力。3D培养的类器官保留了具有神经干细胞、神经母细胞和分化中神经元的结构化组织。移植后，它们被宿主CD31阳性ECs强健地血管化，并且显示出比解离的神经祖细胞移植更好的存活率。免疫荧光揭示了增殖的神经祖细胞、神经母细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系细胞，表明多谱系分化。移植物还表现出新生的轴突和皮层神经元标志物。这些发现证明脑类器官整合到宿主组织中，接受血管支持，并经历神经分化，支持它们作为CNS损伤的移植策略的使用，并作为研究神经发育和再生的平台。此外，自体iPSC衍生的类器官可以减少免疫排斥，并作为研究宿主-移植物免疫相互作用的模型。来自iPSC的患者特异性vBOs支持个性化疾病建模和药物筛选，为个体疾病机制和治疗反应提供了见解。
5 血管化脑类器官的当前局限与未来展望
尽管取得了显著进展，vBOs仍然面临关键限制，阻碍了其作为生理相关和临床适用模型的全部潜力。一个主要问题是BBB的不完全重现。虽然一些系统表现出短暂的紧密连接和选择性通透性，但这些结构通常缺乏完全的成熟度和复杂性。功能评估，如TEER测量和转运蛋白分析，执行不一致，限制了模型间的比较和验证。
另一个重大挑战在于血管网络的长期稳定性和功能性。没有持续灌注，血管结构会随时间退化，损害营养和氧气交换。虽然体内移植改善了血管成熟，但它限制了可扩展性，并引发了伦理和技术问题。
展望未来，系统地评估主要血管化策略的成本效益、血管成熟度和主要应用场景，以指导特定治疗流程的平台选择，将非常重要。vBOs的最新比较分析表明，共培养和基因诱导方法相对便宜且易于并行化，使其适用于中高通量疾病建模，而微流体灌注系统提供卓越的BBB保真度，但复杂性更高，通量更低，将其定位用于机制驱动的BBB和CNS药物递送研究。相比之下，体内移植和混合策略实现了最成熟和可灌注的血管系统，但它们对动物宿主和手术专业知识的依赖性限制了可扩展性，表明它们最强的近期影响将在于概念验证再生疗法和后期疗效测试，而不是常规筛选。
此外，当前的vBOs经常缺乏关键的辅助细胞类型，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、周细胞和免疫细胞——这些是BBB成熟、神经血管耦合和模拟炎症反应的关键组成部分。这种缺失限制了它们在研究神经炎症和复杂退行性过程中的适用性。大多数vBO模型也类似于胎儿脑组织，捕捉成人样表型的能力有限。推动成熟朝向更具生理相关性的状态需要延长培养时间和精确的生化线索，这在体外难以维持。技术可重复性是另一个障碍，因为干细胞分化、血管整合和3D培养条件的变异性导致批次间不一致，降低了它们在药物测试和疾病建模中的可靠性。此外，关于人-动物嵌合体和患者来源的可植入构建体的伦理考虑需要更清晰的监管框架和社会共识，特别是随着vBO复杂性的增加。
为了克服这些挑战，新兴的生物工程方法正在被积极探索。动态微流体平台、3D生物打印和合成支架有望提供更好的空间控制、层次化结构和持续灌注，以稳定血管网络。人工智能可以支持培养方案的标准化，而数字孪生模型可能能够基于实验数据对类器官行为进行预测模拟。整合免疫细胞、血管周围组件和模拟系统相互作用——如肠-脑轴或神经免疫轴——可以显著增强vBOs的生理相关性，并拓宽其在神经血管疾病建模中的适用性。
血管化代表了类器官技术的一项基础性进步，实现了营养交换、神经成熟和神经血管相互作用的更精确模拟。vBOs在模拟涉及BBB、脑灌注不足和神经血管功能障碍的疾病方面超越了传统类器官。除了改善灌注，血管化还增强了神经回路复杂性、代谢调节和屏障功能，巩固了其在疾病建模和治疗开发中的重要性。展望未来，光遗传血管控制、合成血管模式化和先进生物制造技术等创新策略为构建精确、动态的NVUs提供了机会。与患者来源的iPSC和个性化基因组编辑的整合将进一步加速精准医疗，而将vBOs与实时生物传感器监测相结合可以推进高通量药物筛选平台。
6 结论
- 1.
血管化仍然是脑类器官研究中最紧迫的瓶颈之一，从根本上限制了类器官的大小、神经元成熟度和生理保真度。没有足够的血管形成，扩散限制损害了氧气和营养输送，导致较大构建体中出现缺氧和坏死。解决这一障碍对于释放脑类器官在疾病建模和转化医学中的全部潜力至关重要。
- 2.
最近的生物工程方法——如内皮细胞共培养、转录因子介导的血管诱导、微流体灌注、3D生物打印和混合策略——共同推进了血管网络的结构和功能整合。这些方法不仅改善了神经元群体的存活和成熟，还促进了类器官微环境中BBB样特性的建立。
- 3.
尽管有这些进展，当前的vBO系统面临重大限制，包括不完全的BBB重现、血管网络在长期培养期间的不稳定性以及显著的批次间变异性。这些限制阻碍了vBO技术在实验室间的可重复性、可扩展性和广泛采用。
- 4.
下一代工具的整合——动态灌注生物反应器、仿生合成支架和人工智能驱动的培养参数优化——为克服当前障碍提供了一条有前景的途径。此类技术能够实现持续的养分和氧气输送，完善血管的空间模式化，并增强实验的可重复性。
- 5.
vBOs的转化应用正在迅速出现，在模拟复杂神经血管疾病、评估CNS药物开发的BBB通透性以及作为再生医学平台方面具有潜力。然而，成功的临床转化需要标准化方案、监管协调以及涉及学术界、工业界和医疗系统的多部门合作。
- 6.
vBO研究的未来在于干细胞生物学、生物材料工程和器官芯片技术的持续融合。跨学科伙伴关系对于开发生理准确、可扩展和可定制的脑类器官平台至关重要，这些平台忠实地模拟人类神经血管生物学，并支持神经科学和医学的突破。
