《The FASEB Journal》：hnRNPU Safeguards Oocyte Development and Female Fertility via Regulation of Alternative Splicing
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本研究发现异质核核糖核蛋白U（hnRNPU）通过调控线粒体功能相关基因的选择性剪接（AS），在卵母细胞发育过程中发挥关键作用。研究者通过构建卵母细胞特异性Hnrnpu基因敲除（cKO）小鼠模型（Zp3-Cre和Gdf9-Cre），发现hnRNPU缺失会导致卵泡发育阻滞、减数分裂异常、线粒体功能障碍（表现为膜电位下降、ATP耗竭、ROS累积）以及卵母细胞-颗粒细胞通讯受损，最终引发雌性完全不孕。该研究揭示了hnRNPU通过转录调控和剪接调控双重机制维持卵母细胞质量的新途径，为女性不育相关疾病（如早发性卵巢功能不全POI）提供了新的分子靶点。
hnRNPU在卵母细胞发育过程中的动态定位
免疫荧光分析显示，hnRNPU在卵巢组织中主要定位于原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡的卵母细胞核内。在分离的生发泡（GV）期卵母细胞中，hnRNPU同样呈现核内定位。随着卵母细胞成熟至中期I（MI）和中期II（MII）阶段，hnRNPU转位至染色体区域。在早期胚胎的各发育阶段（受精卵、2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚），hnRNPU持续存在于细胞核中，表明其在卵母细胞发育和早期胚胎发生过程中具有动态的亚细胞定位特征。
卵母细胞特异性敲除Hnrnpu损害卵泡发育并导致雌性不育
为探究hnRNPU的生理功能，研究者利用Zp3-Cre（在初级卵泡卵母细胞中激活）和Gdf9-Cre（在原始卵泡卵母细胞中激活）转基因小鼠系，分别构建了卵母细胞特异性Hnrnpu条件性敲除（cKO）小鼠模型（ZcKO和GcKO）。免疫染色证实了hnRNPU在突变小鼠卵母细胞中的特异性缺失。成年ZcKO和GcKO雌鼠的卵巢体积显著缩小，后者表型更为严重。与野生型对照相比，两种cKO雌鼠在与有生育能力的雄鼠交配6个月内均未产生后代，表现为完全不孕。组织学分析显示，3周龄ZcKO小鼠卵巢中次级卵泡和窦卵泡数量显著减少，而GcKO卵巢从初级卵泡阶段开始即出现卵泡数量下降。8周龄时，ZcKO卵巢中次级卵泡向窦卵泡的转换严重受损，窦卵泡数量大幅减少，而GcKO卵巢中则完全缺失窦卵泡。这些结果表明hnRNPU缺失导致卵泡发育阻滞，且缺失发生越早（Gdf9-Cre），卵巢缺陷越严重。
Hnrnpu敲除导致卵母细胞减数分裂成熟缺陷
通过孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导超数排卵，发现ZcKO和GcKO雌鼠均无法产生成熟的MII期卵母细胞。体外培养实验进一步表明，ZcKO小鼠的GV期卵母细胞数量显著减少，GcKO小鼠则几乎无法获取GV卵母细胞。ZcKO的GV期卵母细胞在体外培养4小时后，生发泡破裂（GVBD）率急剧下降。培养至8小时（MI）和16小时（MII）后，ZcKO卵母细胞无法正常形成纺锤体，亦不能排出第一极体。免疫荧光染色显示突变卵母细胞存在纺锤体组装紊乱、染色体排列异常以及极体形态异常等问题。结果表明，hnRNPU是卵母细胞减数分裂进程所必需的，Zp3-Cre介导的缺失导致卵母细胞阻滞在GV期，而Gdf9-Cre介导的缺失引起了更早期的发育阻滞。
Hnrnpu敲除扰乱母源转录组及线粒体相关基因的选择性剪接
对对照组和ZcKO组GV期卵母细胞进行单细胞RNA测序（Smart-seq2），鉴定出大量差异表达基因（DEGs），其中2496个基因上调，1530个基因下调。基因本体（GO）富集分析显示，上调基因主要富集于细胞黏附分子、细胞连接组织和对卵泡刺激素（FSH）的应答等通路，而下调基因则与ATP代谢过程和线粒体功能调控相关。qRT-PCR验证了部分差异表达基因（如Notch1、Edn1、Epha3上调，CYTB、ND4、COX15、COX1下调）。对已发表的hnRNPU染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据的再分析表明，hnRNPU在差异表达基因的转录起始位点（TSS）有显著富集，提示其可能直接调控这些基因的转录。选择性剪接（AS）分析发现，ZcKO卵母细胞中存在479个异常AS事件，其中外显子跳跃（SE）事件占比最高（69.1%）。GO分析表明，发生异常剪接的基因主要与线粒体功能调控、凋亡信号通路和卵母细胞减数分裂相关。通过RT-PCR验证了四个线粒体功能相关基因（Mtx1、Alkbh7、Trp53、Parl）的异常剪接事件。特别值得注意的是，Trp53基因（编码P53蛋白）的异常剪接产生了具有更长3‘非翻译区（3’UTR）的转录本，这可能解释了在突变卵巢中通过免疫荧光观察到的P53蛋白水平显著升高。
Hnrnpu敲除导致卵母细胞线粒体功能异常
MitoTracker Red染色显示，ZcKO GV期卵母细胞中线粒体发生显著的核周聚集。JC-1染色表明线粒体膜电位显著降低。ATP含量测定显示ZcKO卵母细胞ATP水平下降。使用DCFH-DA和MitoSOX Red染色分别检测细胞内总活性氧（ROS）和线粒体ROS水平，发现ZcKO卵母细胞中两者均显著升高。这些结果综合表明，hnRNPU缺失导致线粒体功能严重受损，包括分布异常、膜电位去极化、能量代谢障碍和氧化应激加剧。
Hnrnpu缺失损害卵母细胞-颗粒细胞通讯并诱导卵泡凋亡
免疫荧光染色显示，在ZcKO卵巢的初级和次级卵泡中，细胞黏附分子N-钙黏蛋白和β-连环蛋白的表达水平急剧下降。颗粒细胞增殖标志物Ki67的阳性细胞数减少，表明颗粒细胞增殖受阻。TUNEL凋亡检测发现ZcKO卵巢中凋亡细胞数量显著增加。这些发现说明hnRNPU缺失破坏了卵母细胞与周围颗粒细胞之间的通讯连接，抑制了颗粒细胞增殖，并促进了卵泡凋亡，共同导致了卵泡发生缺陷和不育。
讨论
本研究首次揭示了hnRNPU在卵母细胞发育中的关键作用，特别是其通过调控线粒体功能相关基因的转录和选择性剪接来维持卵母细胞质量的新机制。hnRNPU的动态定位提示其可能在不同发育阶段发挥多重功能。卵母细胞特异性敲除hnRNPU导致严重的卵泡发育阻滞和减数分裂缺陷，表型严重程度与敲除发生的时间点（Gdf9-Cre早于Zp3-Cre）相关。转录组和剪接组分析揭示了母源转录组的广泛紊乱以及线粒体功能相关基因的剪接异常。线粒体功能检测证实了hnRNPU缺失导致的功能障碍，其表现（如线粒体聚集、膜电位降低、ATP耗竭、ROS升高）与卵巢衰老过程中的线粒体变化有相似之处。此外，hnRNPU缺失还破坏了卵母细胞-颗粒细胞间的双向通讯，导致颗粒细胞增殖受损和凋亡增加。这些发现不仅深化了对卵母细胞发育调控机制的理解，也为女性不育症（如早发性卵巢功能不全POI）的病因研究和潜在治疗靶点探索提供了新的视角。未来的研究可进一步阐明hnRNPU调控线粒体活性和细胞通讯的下游信号通路，并探索其在卵巢衰老过程中的作用。
