《Pharmacological Research》：Study on epigenetic regulatory mechanism of MBD4 with a germline loss-of-function mutation (rs140693) responsible for retinoblastoma chemoresistance via the cell cycle and apoptotic pathways
编辑推荐：
本研究针对高危晚期视网膜母细胞瘤化疗耐药这一临床难题，通过多组学分析发现MBD4基因胚系功能缺失突变(rs140693)可通过表观遗传学调控下游细胞周期与凋亡关键基因(FADD、P21等)表达，从而影响肿瘤对卡铂/依托泊苷的敏感性。体内外实验证实MBD4缺失会降低DNA损伤诱导的G2/M期阻滞和细胞凋亡，其突变体因与USP7结合减弱导致蛋白稳定性下降。该研究首次揭示MBD4在视网膜母细胞瘤化疗应答中的新功能，为个体化治疗提供新靶点。
在儿童眼内恶性肿瘤中，视网膜母细胞瘤占据着不容忽视的地位。尽管当前化疗方案不断优化，但高危晚期患者依然面临严峻挑战——化疗耐药导致的复发和转移，成为提高生存率的瓶颈。尤其在中国，这类患儿的五年生存率仅有26%，伴随高致盲率和死亡率。传统研究多聚焦于基因组变异，但表观遗传调控在肿瘤发生发展中的作用日益凸显。
为破解这一难题，研究人员将目光投向胚系变异。他们通过对8例高危晚期视网膜母细胞瘤患者外周血进行全外显子测序和简化表征亚硫酸氢盐测序，从17个候选基因中锁定MBD4——一个携带胚系功能缺失突变(rs140693)的表观遗传调控因子。该突变在东亚人群中出现频率高达41.9%，而在其他人群中仅占11.1%，这或许能解释为何其重要性长期被忽视。
研究团队通过一系列精巧实验揭示：MBD4下调会显著削弱卡铂和依托泊苷的疗效。在MBD4敲除的Y79细胞中，FADD、P21、FLIP、P57和P18这五个关键基因的表达明显下降，且其启动子区DNA甲基化水平升高。进一步机制研究表明，MBD4能直接结合这些基因的启动子区域调控其转录活性。更有趣的是，rs140693突变会导致MBD4蛋白与去泛素化酶USP7结合减弱，通过泛素-蛋白酶体途径加速降解，从而影响其功能。
在动物实验中，MBD4缺陷的移植瘤对化疗药物敏感性显著降低，而恢复野生型MBD4表达则能重新敏化肿瘤细胞。这些发现共同阐明了一个新机制：MBD4通过表观遗传方式调控细胞周期和凋亡通路关键基因，进而影响视网膜母细胞瘤的化疗应答。
关键技术方法包括：利用8例患者样本进行全外显子测序和简化表征亚硫酸氢盐测序筛选候选基因；通过CRISPR/Cas9技术构建MBD4敲除的Y79细胞系；采用甲基化DNA捕获PCR、染色质免疫共沉淀等技术分析DNA甲基化状态和蛋白-DNA相互作用；借助细胞系来源移植瘤模型和Lewis肺癌转移模型进行体内验证；结合生物信息学分析多癌种中MBD4的变异频率和通路富集情况。
- 2.
结果
2.1. MBD4及其胚系变异与视网膜母细胞瘤预后相关
研究人员发现rs140693突变在复发组中出现显著富集。临床验证显示，该突变携带者的复发风险增加69.6%，而缓解组中仅有43.2%携带该突变(P=0.0099)。
2.2. MBD4缺失导致化疗耐药
MBD4敲除显著降低Y79细胞对卡铂和依托泊苷的敏感性。流式细胞术显示，MBD4缺失削弱了卡铂诱导的G2/M期阻滞和细胞凋亡。
2.3. MBD4通过表观遗传调控下游基因
MBD4能直接结合FADD、P21等基因启动子区，调控其转录活性。rs140693突变导致MBD4蛋白稳定性下降，泛素化水平升高，与USP7结合能力减弱。
- 3.
MBD4调控细胞周期和凋亡通路
MBD4缺失导致FADD、P21等蛋白表达下调，进而影响caspase-8和caspase-3的活化。回复实验表明，过表达FADD能部分逆转MBD4缺失引起的化疗耐药。
- 4.
体内实验验证
在细胞系来源移植瘤模型中，MBD4缺陷肿瘤生长更快，对化疗药物反应差。在肺转移模型中，MBD4敲除小鼠的化疗抑制率仅为野生型的50%左右。
讨论与结论：
本研究首次揭示MBD4在视网膜母细胞瘤化疗应答中的关键作用。其胚系功能缺失突变rs140693通过影响蛋白稳定性，削弱对下游细胞周期和凋亡基因的表观遗传调控，最终导致化疗耐药。这一发现不仅为理解视网膜母细胞瘤耐药机制提供新视角，也为个体化治疗提供潜在生物标志物。针对MBD4信号通路的干预可能成为克服化疗耐药的新策略，尤其对携带该突变的东亚人群具有重要临床意义。
