《The Journal of Physiology》：Impact of time-restricted feeding on metabolic health and adipose tissue metabolism in aged female mice with high-fat diet-induced obesity
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本综述系统探讨了限时喂养（TRF）在老年雌性高脂饮食（HFD）诱导肥胖模型中对能量平衡、白色脂肪组织（WAT）代谢及整体代谢健康的调节作用。研究发现，TRF能部分逆转HFD导致的体重增加和脂肪堆积，改善脂肪细胞大小分布异质性，增强能量消耗（VO2/VCO2），降低呼吸交换率（RER），并上调脂肪生成、脂质循环及线粒体氧化相关基因表达。TRF通过调节脂肪组织代谢适应性，为改善老龄女性肥胖相关代谢疾病提供了潜在饮食策略。
引言
随着肥胖和糖尿病患病率的上升，研究饮食模式如何影响能量平衡、脂肪组织代谢、胰岛素抵抗和整体代谢健康的重要性日益凸显。年龄增长会增加肥胖及相关代谢疾病（如2型糖尿病和心血管疾病）的风险。因此，识别有效的饮食干预措施以控制老龄化过程中的肥胖，对于减轻慢性代谢疾病的负担至关重要。在众多策略中，间歇性禁食（IF），特别是限时喂养（TRF），通过限制每日进食窗口，帮助恢复因现代饮食模式而紊乱的昼夜节律，已成为一种在不必然减少热量摄入的情况下改善代谢健康的有前景的方法。
脂肪组织在新陈代谢中扮演核心角色。研究表明，脂肪组织对衰老环境高度敏感，其功能障碍可能导致机体衰老和年龄相关疾病的发生。慢性低度炎症是这一过程的关键因素，常见于肥胖和衰老过程中，这种现象被称为“炎症衰老”（inflammaging），其特征是促炎细胞因子水平升高和炎症通路激活。同时，线粒体功能障碍在肥胖和衰老中都很常见，加上炎症衰老，增加了对胰岛素抵抗和动脉粥样硬化等代谢紊乱的易感性。因此，了解TRF如何在老年、饮食诱导的肥胖模型中影响脂肪组织代谢和功能，对于制定对抗年龄相关代谢功能障碍的策略至关重要。
脂肪组织通常分为棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT），它们在形态、基因表达和代谢功能上有所不同。棕色脂肪细胞特征为多个小脂滴，通过产热作用贡献于能量消耗。相反，白色脂肪细胞包含一个大的脂滴。在WAT中，胰岛素通过促进脂肪酸和葡萄糖摄取以及甘油三酯合成来刺激能量储存。在能量不足条件下，储存的甘油三酯经历脂解，释放脂肪酸和甘油供组织利用。过量的热量消耗通过增生和肥大机制导致脂肪组织扩张。研究表明，高脂饮食（HFD）诱导的脂肪组织扩张在早期暴露阶段同时发生脂肪细胞增生和肥大，但随着HFD喂养时间的延长，脂肪细胞肥大持续，而脂肪细胞数量下降，表明随着时间的推移，脂肪生成受损。
衰老还与基础代谢率（BMR）的自然下降有关，这是由于去脂体重的减少和激素调节的变化所致。这导致肥胖逐渐增加，脂肪从皮下重新分布到内脏储库。此外，研究表明，老年肥胖个体的基础脂肪氧化和最大氧化能力降低，老年小鼠在体力活动期间的能量消耗和最大耗氧量（VO2max）也低于年轻小鼠。衰老还会损害对营养挑战的代谢适应性，进一步增加代谢紊乱的风险。
TRF已被证明通过调节脂肪细胞大小、分布和功能来影响脂肪组织代谢。TRF的机制是多方面的，影响脂肪组织内的各种代谢通路。许多TRF研究使用长期喂养高脂饮食的小鼠来模拟人类饮食模式，特别是西方饮食。尽管多项研究报告了TRF在年轻雄性小鼠中的代谢益处，并有证据表明每个脂肪储库对TRF方案的反应不同，但对其在老年、饮食诱导肥胖的雌性小鼠中脂肪组织代谢的储库特异性影响了解有限。重要的是，一项使用绝经后雌性小鼠模型的研究表明，TRF导致快速体重减轻、改善葡萄糖耐量并减少肝脏脂质积累，同时伴随着肝脏代谢从糖异生向酮体生成的转变。这与绝经后女性面临的独特代谢风险高度相关。然而，大多数临床前代谢研究依赖于年轻的雄性啮齿动物，忽视了疾病病理生理学和治疗反应中与性别和年龄相关的差异。这一研究空白限制了研究结果对老年女性这一高风险且不断增长的患者群体的转化相关性。因此，本研究旨在研究TRF对患有HFD诱导肥胖的老年雌性小鼠的能量消耗、代谢健康结局和三个不同脂肪储库中脂肪组织代谢的影响。
方法
伦理批准
所有程序均经明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC 2102A38852）批准，并遵循NIH实验动物护理指南。动物处死程序：本研究未使用麻醉剂进行动物处死。取而代之的是，根据明尼苏达大学IACUC批准的方案，采用二氧化碳（CO2）吸入法。
动物研究
动物饲养于明尼苏达大学的特定无病原体设施中，环境温度为22°C。该研究包括27只老年（14-18月龄）雌性C57BL/6小鼠。其中20只小鼠喂食HFD 12周以诱导肥胖，而另外7只小鼠维持正常饮食（对照组）。12周后，HFD喂养的小鼠被分为两组：10只继续随意进食HFD（HFD-AL组），10只转为限时喂养（HFD-TRF组）。此外，还招募了11只3月龄的雌性小鼠进行中年研究。这些包括4只正常饮食对照组、4只HFD-AL组和3只HFD-TRF组。经过12周的HFD喂养后，这些小鼠达到6月龄，并继续维持HFD-AL或转为TRF喂养额外10周。实验时间线见图1。AL组持续有食物供应，TRF组在活跃（黑暗）期每天有10小时的进食窗口。小鼠以每组3-4只群养，自由饮水，处于12小时光/暗循环（光照关闭时间为12-24 ZT，即晚上8点至早上8点）。HFD-TRF组的食物供应时间为晚上8:30至早上6:30。提供给小鼠的高脂饮食是60% HFD，正常饮食由动物设施提供。根据制造商信息，HFD含有20.5%蛋白质、36%脂肪和35.7%碳水化合物，而正常饮食含有20.5%蛋白质、7.2%脂肪和61.6%碳水化合物。关于脂肪类型，该饮食主要脂肪来源为猪油。在TRF方案的第6周进行葡萄糖耐量试验（GTT），第7周进行胰岛素耐量试验（ITT）。第8周将小鼠置于代谢笼中。连续三天测量食物摄入量。经过10周的饮食干预后，所有三组小鼠在禁食16小时后被处死。处死后通过心脏穿刺收集血液。收集棕色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、附睾脂肪组织、肾周脂肪、肾脏、肝脏和肌肉并称重。棕色脂肪组织和肝脏的组织切片用于组织学分析，而腹股沟和附睾脂肪组织的小部分用于组织学分析和脂肪细胞大小测定，剩余组织在液氮中速冻并储存以备后续分析。
间接测热法和体重
使用Echo MRI 3-in-1测量身体成分（脂肪量和去脂体重，单位克）。在TRF方案的第8周，将小鼠单独笼养，并使用Biodaq食物摄入监测系统在5天内测量食物摄入量。取食物摄入监测最后2天的平均值确定总食物摄入量（克/天）。使用Oxymax综合实验室监测系统在3天内测量间接测热法参数（耗氧量VO2、二氧化碳产量VCO2、产热量、呼吸交换率RER和活动量）。使用最后的光照和黑暗周期数据来统计确定实验组之间的能量消耗差异。
脂肪细胞大小测定
从对照组或HFD喂养（含或不含TRF）小鼠的腹股沟和附睾WAT获取脂肪组织样品。立即将组织样品（25-30 mg）固定在12 ml的2%四氧化锇（溶于collidine缓冲液）溶液中，并在37°C水浴中孵育48小时。随后冲洗并过滤收集固定细胞，使用光学颗粒分析仪（Microtrac SIA）分析样品，测量颗粒尺寸范围为50 nm至2800 μm。每个样品重复测量两次。使用GraphPad Prism 9.5.1生成图表。
葡萄糖和胰岛素耐量试验
GTT在TRF方案的第6周进行。小鼠禁食16小时，记录体重。腹腔注射葡萄糖 bolus（0.75 g/kg体重），在注射前及注射后15、30、45、60、90、120分钟从尾静脉测量血糖。ITT在TRF方案的第7周进行。小鼠在注射前禁食4小时，记录体重。腹腔注射胰岛素 bolus（0.75 U/kg体重），在注射前及注射后相同时间点测量血糖。
组织苏木精-伊红（H&E）染色
组织在10%中性缓冲福尔马林中固定2-3天，在70%乙醇溶液中脱水3-5天，并进行石蜡包埋处理。组织样品在明尼苏达大学组织学核心使用标准方案进行H&E染色。简要过程为：脱蜡、复水后，以5-6 μm厚度切片，苏木精染色1分钟，蒸馏水冲洗，然后用伊红溶液复染1分钟，接着通过95%和100%乙醇脱水，二甲苯透明。最后用树脂封片剂封片。使用Leica DM IL显微镜捕获图像。
定量实时PCR
使用TRIZOL试剂从冷冻组织中提取总RNA，并在cDNA合成前用DNA酶处理去除基因组DNA。使用Superscript II逆转录酶试剂盒进行逆转录。使用FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)和QuantStudioTM 3实时PCR系统进行实时定量PCR。采用??Ct方法计算mRNA表达量。以TATA框结合蛋白（Tbp）mRNA作为内参基因。用于扩增目的基因的引物序列见表1。
血清分析
使用Triglycerides Enzymatic Assay Kit测定血清甘油三酯水平。使用Free Fatty Acid Quantitation Kit和β-Hydroxybutyrate Assay Kit根据制造商说明书测定血清游离脂肪酸和β-羟基丁酸水平。
统计分析
结果以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism（版本9.4.1）对老年和中年雌性小鼠的数据进行分析。比较两组时使用Student's t检验，比较两组以上时使用单因素方差分析（one-way ANOVA）。统计学显著性定义为P值 < 0.05。
结果
TRF对老年雌性小鼠体重和肥胖的影响
为研究TRF对老年小鼠代谢健康的有益影响，我们将14-18月龄的小鼠喂食HFD 12周，然后分为HFD-AL或HFD-TRF组继续喂养10周。在TRF期间，HFD-AL组与对照组相比体重增加无显著差异，而HFD-TRF组与对照组和HFD-AL组相比，体重增加显著减少。具体而言，在第2、4、6和7周，HFD-TRF组的体重变化显著低于HFD-AL组。与对照组相比，HFD-AL小鼠的平均体重和总脂肪量均显著更高。TRF部分逆转了HFD诱导的这种增加，但其水平仍显著高于对照组。各组间去脂质量无差异。在脂肪组织重量（占体重的百分比）方面，与对照组相比，HFD-AL组的腹股沟WAT（Ing-WAT）和性腺WAT（Gon-WAT）显著增加，而BAT或肾周WAT（P-WAT）无变化。与对照组相比，HFD-TRF组的BAT、Ing-WAT和Gon-WAT显著增加，P-WAT无变化。然而，HFD-AL组和HFD-TRF组之间脂肪组织占体重的百分比无显著差异，仅HFD-TRF组的Ing-WAT有下降趋势。器官重量也受到影响。与对照组相比，HFD-AL小鼠的肾脏、肝脏和心脏重量显著增加。与HFD-AL小鼠相比，TRF显著降低了心脏重量，并显示出肝脏和肾脏重量降低的趋势。肝脏的组织学分析显示，HFD-AL组有明显的脂质积累，表明肝脏内有显著的异位脂肪沉积。与HFD-AL小鼠相比，HFD-TRF小鼠的肝脏脂质积累明显减少，但其水平仍高于对照组。
TRF对老年雌性小鼠食物摄入和进食行为的影响
总体食物摄入量在各组间具有可比性，HFD-AL和HFD-TRF组的摄入量略有增加。在进食窗口期间，与对照组和HFD-AL组相比，HFD-TRF组在0-5小时和5-10小时间隔内消耗的食物显著更多。相反，在非活动期（HFD-TRF小鼠无法获取食物时），对照组和HFD-AL小鼠消耗了大约其每日摄入量的30%。进食频率分析显示，在0-5小时和5-10小时期间（TRF指定的进食窗口），HFD-TRF组与对照组相比显著增加。HFD-TRF组的进食频率在0-5小时期间也显著高于HFD-AL组，但在5-10小时期间无显著差异。在非活动期，HFD-AL小鼠的进食频率高于对照组。各组间进食量无显著差异，但HFD-AL组有下降趋势。如图3E所示，与对照组相比，HFD-AL和HFD-TRF组的进食持续时间（每餐时间）显著缩短，这可能是由于HFD的热量密度较高所致。
TRF对老年雌性小鼠能量消耗的影响
间接测热法分析显示，与对照组相比，HFD-AL和HFD-TRF组在光照和黑暗周期内的VO2和VCO2均显著降低。然而，与HFD-AL组相比，TRF显著增加了VO2和VCO2，尽管其值仍低于对照组。呼吸交换率（RER）在光照周期（0-12 ZT）遵循类似模式，HFD-TRF组与HFD-AL组相比显示出更大的降低。在黑暗期（12-24 ZT），HFD-AL和HFD-TRF组的RER均低于对照组，但两组间无显著差异。在光照周期，HFD-AL和HFD-TRF组小鼠的活动水平与对照组相比显著降低。在黑暗周期（小鼠通常更活跃时），HFD-AL组的活动量相对于对照组有所减少，但不显著。这种减少被TRF部分逆转。与对照组相比，HFD-AL和HFD-TRF组在光照和黑暗周期内的产热量均增加。值得注意的是，HFD-TRF组的产热量低于HFD-AL组，有向对照水平回归的趋势。这些结果表明，TRF可以部分抵消HFD诱导的老年雌性小鼠能量消耗的减少。
TRF对老年雌性小鼠白色脂肪组织可塑性的影响
为理解TRF如何影响脂肪组织可塑性，评估了Ing-WAT和Gon-WAT中的脂肪细胞大小分布。在Ing-WAT中，与对照组相比，HFD喂养导致150-200 μm大小的脂肪细胞群体显著增加。与对照组相比，TRF显著减少了75-100 μm脂肪细胞群体，但增加了150-200 μm群体。此外，与HFD-AL小鼠相比，TRF显著增加了25-50 μm脂肪细胞的百分比。总体而言，与对照组和HFD-TRF组相比，HFD-AL组的平均脂肪细胞直径显著增加。尽管TRF部分逆转了这种增大，但HFD-TRF组的脂肪细胞仍显著大于对照组。Ing-WAT切片的H&E染色证实了这些形态学变化。
相反，在Gon-WAT储库中观察到更明显的变化。在HFD-AL组中，与对照组相比，75-100 μm和100-150 μm脂肪细胞群体显著减少，而较大的脂肪细胞群体（150-200 μm）增加。与对照组和HFD-AL组相比，TRF显著增加了25-50 μm和150-200 μm脂肪细胞群体的百分比，同时减少了75-150 μm群体。在Gon-WAT的平均脂肪细胞直径方面，HFD-AL和HFD-TRF组均显示与对照组相比显著增加。H&E染色支持这些发现，显示HFD-AL组相对于对照组脂肪细胞增大，而在HFD-TRF组观察到部分逆转。这些数据表明，TRF促进了Gon-WAT中更异质的脂肪细胞群体，混合了更小和更大的脂肪细胞，而HFD-AL喂养导致更同质的群体，以更大的脂肪细胞为主。
TRF对老年雌性小鼠代谢健康的影响
为评估TRF对代谢健康的影响，我们评估了葡萄糖和脂质稳态以及胰岛素敏感性。GTT和ITT揭示了各组间不同的代谢反应。HFD-AL组表现出适度的葡萄糖耐量受损，GTT期间血糖水平升高。HFD-AL组的胰岛素敏感性显著降低，ITT期间血糖水平更高。然而，TRF并未改善葡萄糖耐量，但显示出增强HFD喂养的老年雌性小鼠胰岛素敏感性的趋势。处死时的空腹血糖水平在HFD-AL组显著高于对照组。TRF部分逆转了这种升高，但未达到对照水平。与对照组相比，HFD-TRF组的血清游离脂肪酸（FFA）和甘油三酯有上升趋势，但HFD-AL和HFD-TRF组之间未观察到显著差异。此外，三个实验组之间的血清β-羟基丁酸水平无显著差异。
TRF对老年雌性小鼠BAT代谢的影响
接下来我们检测了TRF对BAT代谢的影响，重点关注线粒体功能、脂质代谢和产热相关关键基因的表达。组织学分析显示，HFD-AL组的BAT脂滴大小增加，而TRF显著逆转了这种增大。基因表达分析显示，各组间产热基因如Ucp1、Cidea和Tfam无显著变化。然而，参与线粒体生物合成和氧化代谢的基因发生显著改变。具体而言，HFD-AL显著上调了Erra、Atp5b和Cpt1的表达，而TRF逆转了Erra和Atp5b的表达，并下调了Pgc1a的表达。HFD-AL还降低了脂生成和脂解基因的表达，包括Scd1、Elovl5和Atgl。TRF部分或完全恢复了这些基因的表达，表明TRF可以逆转HFD诱导的BAT中脂生成-脂解无效循环的中断。有趣的是，TRF还恢复了被HFD改变的昼夜节律相关基因的表达。与对照组相比，HFD抑制了BAT中Bmal1基因的表达，但TRF将其恢复至对照水平。相反，HFD升高了Per1的表达，而TRF将其降低回对照水平。这些发现表明，TRF可以抵消HFD诱导的老年雌性小鼠BAT中线粒体代谢、脂质循环和昼夜节律调节的损害。
TRF对老年雌性小鼠性腺白色脂肪组织代谢的影响
接下来我们检测了Gon-WAT中参与脂肪生成、脂质代谢、衰老、炎症和昼夜节律的基因表达。与对照组和HFD-AL组相比，TRF显著增加了脂肪生成基因（包括Pparg及其下游靶点Lpl和Glut4）的表达。HFD显著上调了关键脂生成转录因子Srebp-1c，而TRF进一步增加了其表达。尽管HFD抑制了Fasn的表达，但TRF显著提高了其表达。关于脂解基因，与对照组相比，HFD显著下调了Atgl的表达，但TRF将其恢复至接近对照水平。Hsl表达未显示显著变化。
我们还评估了Gon-WAT中的昼夜节律基因表达。与对照组相比，HDF-AL组Clock和Bmal1显著降低，TRF未能恢复它们的表达。HFD使Per1表达有升高趋势，而TRF显著降低了其表达。对于与衰老、SASP和炎症相关的基因，HFD显著上调了p16和p21（细胞衰老标志物），而TRF未能逆转这些变化。促炎细胞因子Tnfa和Mcp1在HFD-AL组中升高，但TRF部分减轻了这些升高。总体而言，这些发现表明，TRF可以通过上调脂肪生成基因和部分逆转/减轻HFD诱导的脂生成、脂解和炎症变化来调节Gon-WAT中的基因表达。然而，TRF对衰老标志物和昼夜节律基因的影响有限，突出了饮食、代谢健康和昼夜节律调节之间复杂的、储库特异性的相互作用。
TRF对老年雌性小鼠腹股沟白色脂肪组织代谢的影响
为探索TRF如何影响Ing-WAT的代谢适应，我们分析了参与脂肪生成、脂质代谢、线粒体功能、衰老、炎症和昼夜节律的基因表达。HFD显著上调了Pparg及其靶基因Glut4，而Lpl无显著变化。TRF显著增加了Lpl的表达，超过对照水平，并显示出增加Glut4的趋势，表明部分逆转了HFD诱导的脂肪生成障碍。脂生成基因Fasn和脂解基因Atgl和Hsl被HFD显著下调。TRF逆转了Fasn和Atgl的抑制，但对Hsl表达无显著影响。在线粒体功能方面，与对照组和HFD-AL组相比，TRF显著上调了Atp5b和Cpt1，表明Ing-WAT中线粒体氧化和ATP生成增强。然而，TRF对HFD诱导的Pgc1a基因下调无逆转作用。
昼夜节律基因评估显示，HFD降低了Clock和Per1基因的表达，而Bmal1显著上调。TRF未显著改变这些表达模式。总的来说，这些发现表明TRF改善了Ing-WAT中的脂生成-脂解循环并增强了线粒体氧化能力，尽管它对老年雌性小鼠的昼夜节律基因表达影响有限。
TRF对中年雌性小鼠体重增加和肥胖的影响
为确定衰老是否影响TRF的有效性，我们还研究了TRF对中年雌性小鼠的影响。如图10所示，HFD-AL组在中年雌性小鼠中表现出显著的体重增加，而老年HFD喂养的雌性小鼠在TRF方案期间体重保持稳定。因此，与老年雌性小鼠相比，TRF在中年雌性小鼠中引起了更明显的体重变化。此外，TRF导致脂肪组织质量更大程度减少，Ing-WAT、Gon-WAT和肾周WAT均观察到显著下降。然而，与老年雌性小鼠相反，TRF未显著影响中年雌性小鼠的器官重量。这些差异可能反映了与年龄相关的代谢适应变化，这可能影响对HFD和TRF等饮食干预的反应性。
讨论
在本研究中，我们调查了TRF对老年雌性小鼠体重、进食模式、能量消耗、脂肪组织可塑性和代谢相关代谢适应的影响。与先前研究表明TRF减少年轻雄性小鼠体重增加一致，我们的结果证明TRF在喂食HFD的老年雌性小鼠中也能有效促进体重减轻。TRF部分逆转了HFD诱导的体重和总脂肪量的增加，尽管两者仍显著高于对照组。在TRF和HFD组之间观察到的脂肪量减少可能部分归因于TRF诱导的心脏、肝脏和肾脏重量减少，表明异位脂肪沉积减少，肝脏脂质积累降低也证明了这一点。在HFD背景下观察到的TRF导致心脏重量减少可能表明其具有心脏保护作用，考虑到与肥胖和HFD相关的心血管疾病风险增加，这一点尤其重要。在评估年龄对TRF结局的影响时，
