《Molecular Ecology》：Life History and Smoltification Shape Genomic Signatures of Thermal Tolerance in Chinook Salmon
编辑推荐：
本研究通过整合生理学与基因组学方法，揭示了奇努克鲑（Oncorhynchus tshawytscha）耐热性受其生活史策略（溪流型与海洋型）和关键发育阶段（银化，smoltification）的深刻影响。研究发现，海洋型种群的临界高温（CTmax）显著高于溪流型，而银化过程普遍降低了所有种群的耐热性，且耐热性在海水环境中个体间变异更大。基因组关联分析（PoolSeq）表明，耐热性相关遗传变异具有种群特异性，但功能富集分析共同指向未折叠蛋白反应（UPR）、内质网应激（ER stress）和离子运输等保守通路。转录组分析进一步发现，溪流型种群中基线基因表达与耐热性关联更强，并鉴定出STARD7、ZNF711等候选基因。研究强调了发育转换与环境背景在塑造鱼类热适应性中的关键作用，为气候变化下的鲑鱼保护管理提供了重要的分子生理学依据。
1 引言
太平洋鲑鱼种群正面临快速环境变化的日益严重的威胁。气候变化导致的积雪减少、地下水可用性降低以及水流模式改变，预计将进一步扰乱淡水生态系统的热状况，这对鲑鱼的产卵、早期发育和洄游至关重要。这些环境压力因人类活动而加剧，对鲑鱼种群的生存构成了总体威胁。在加拿大不列颠哥伦比亚省南部，这些挑战对于具有重要生态、经济和文化价值的奇努克鲑尤为令人担忧。自20世纪60年代以来，由加拿大渔业与海洋部鲑鱼增强计划运营的孵化场项目一直支持着该地区的奇努克鲑种群。这些孵化场维持着具有不同遗传背景和生活史策略的多种种群，为研究种群对气候相关压力因子的生理敏感性差异提供了宝贵框架。特别是早期生命阶段对淡水栖息地高温尤其脆弱，使得热性能成为理解种群对环境变化特异性反应的关键性状。
奇努克鲑表现出两种不同的幼体生活史策略，即溪流型和海洋型，它们在入海时间和淡水居住时间上有所不同。海洋型幼体通常在出生后第一年内迁徙到海洋，通常在入海前利用河口栖息地。相比之下，溪流型幼体在入海前会在淡水中停留一年或更长时间。这些谱系相关的迁徙策略可能影响幼体的热经历，溪流型幼体在淡水中停留时间延长，在此期间淡水环境中的极端高温事件会显著影响其早期生命阶段的生长和存活。因此，理解这些不同的淡水居住策略如何反映在潜在的基因组和分子过程中，可能为奇努克鲑的生理恢复力和适应潜力提供关键的新见解。
一个在不同生活史类型中变化的关键发育过程是银化的时间。在银化过程中，幼体经历广泛的生理变化，以从淡水环境过渡到海洋环境。这些变化包括渗透调节系统的重组、内分泌转变以及代谢、免疫和行为的调整。温度强烈影响银化的时间和进程，较温暖的条件会加速这一过程的开始。然而，高温也可能产生有害影响，例如限制耐盐性的生理窗口、降低游泳速度，甚至诱发“去银化”，即银鲑失去其海水适应能力。尽管对银化的温度敏感性已有较多了解，但关于这些温度依赖性转变如何影响不同生活史的恢复力，特别是在应对极端高温事件方面，人们知之甚少。鉴于气候变化正在改变河流温度和水流模式，导致慢性和急性的热挑战，理解银化如何影响奇努克鲑的耐热性和生理恢复力对于评估溪流型和海洋型种群的适应性至关重要。
热敏感性在奇努克鲑的不同生命阶段和种群间存在差异，这部分是由生活史和饲养环境的变化所塑造的。温度影响关键的生理过程，包括生长、代谢和洄游性能，有证据表明存在种群特异性的热阈值。溪流型种群由于淡水居住时间较长，可能特别容易受到河流变暖和水文变化的影响。海洋型幼体虽然在淡水中停留时间较短，但如果进入高产河口栖息地的机会减少，仍可能面临风险。本研究旨在探讨银化时间和生活史策略如何影响奇努克鲑种群的耐热性，以期理解发育轨迹如何调节对气候驱动环境变化的响应。
基因组方法通过将环境暴露与潜在分子过程联系起来，为研究鲑鱼的耐热性提供了强大的框架。生活史变异，包括淡水居住时间和银化时间的差异，塑造了幼体所经历的热环境，然而这些不同的轨迹如何影响潜在的生理和基因组结构仍知之甚少。比较基因组学方法，如全基因组扫描和转录组分析，可以识别与温度应激反应相关的基因座和调控通路，有助于区分可遗传的遗传变异、可塑性或它们的相互作用。种群基因组分析还可以揭示跨流域和生活史类型的适应性分化，为了解热恢复力的进化基础提供见解，并为保护和孵化场管理提供信息。
本研究整合了生理学和基因组学方法来研究来自不列颠哥伦比亚省南部的奇努克鲑种群的耐热性。我们的目标是识别与热应激恢复力相关的遗传和转录组学相关性，特别关注生活史类型之间的差异以及银化对耐热性的影响。
2 材料与方法
2.1 研究生物
为了研究不同生活史如何影响奇努克鲑在淡水和盐水中耐受高温的能力，我们评估了两种不同生活史类型奇努克鲑的急性耐热性：海洋型（在生命最初几个月内迁徙入海）和溪流型（在入海前在淡水中停留一年或更长时间）。从DFO孵化场获得了大约2000尾奇努克鲑幼鱼，每个种群500尾，在预计银化前几周运至西温哥华的DFO太平洋科学企业中心。这四个种群包括两个溪流型和两个海洋型品系。这些种群的选择使得所有鱼在一年中大约同一时间准备过渡到盐水，尽管两种生活史类型的个体在银化时的年龄不同。溪流型品系（以下简称Ashlu和Shovelnose）是夏季洄游种群，源自Squamish河的不同支流，在DFO Tenderfoot Creek孵化场饲养。海洋型品系源自Fraser河下游的支流：Chehalis（秋季洄游，海洋型）来自DFO Chehalis河孵化场，Chilliwack（夏季洄游，海洋型）来自DFO Chilliwack河孵化场。动物饲养遵循加拿大动物护理委员会指南，所有活体动物程序均获得了加拿大渔业与海洋部太平洋地区和英属哥伦比亚大学动物护理委员会的批准。
2.2 耐热性评估
所有鱼均接受了临界高温（CTmax）试验，这是一种非致死性的急性耐热性测量方法，通过确定鱼在热升温过程中无法维持平衡时的温度来衡量。该方法广泛用于评估鱼类的急性耐热性，该性状与物种生物地理边界和对气候变化的敏感性相关。我们使用了Strowbridge等人概述的方法。简言之，在试验前24小时禁食。鱼以大约100尾为一组进行CTmax试验。所有试验在上午9点至11点之间开始。将鱼从饲养缸捞出并转移至一个含有与饲养缸相同水源的400升试验缸中，使其适应试验缸30分钟。每个CTmax试验开始时平均升温速率为0.26°C/分钟，直至试验缸温度达到18°C，此后升温速率降至0.1°C/分钟直至试验结束。每次试验至少有四人参与：一人监测记录温度，两人观察鱼缸并在鱼失去平衡时捞出，一人扫描PIT标签。鱼一旦失去平衡立即捞出，扫描PIT标签，然后放回含有环境温度水的恢复缸中。
为了评估种群和盐度处理间耐热性的差异，我们使用了线性混合效应模型（LMM），以种群、水体类型（淡水或盐水）及其交互作用作为固定效应，试验作为随机效应以解释实验批次变异。
2.3 DNA测序与遗传分析
从尾鳍夹组织提取DNA。使用TaqMan定量PCR（qPCR）测定法测定奇努克鲑的遗传性别。对于每个种群，从CTmax值最高和最低的25尾雄鱼和25尾雌鱼中汇集基因组DNA，创建“顶级表现者”和“底层表现者”样本，确保每个池包含50个个体且性别平衡。汇集的DNA样本提交给Génome Québec创新中心进行文库制备和高通量测序。使用PoPoolation2流程处理和分析等位基因频率以及顶级和底层表现者之间的遗传分化。为了检测与耐热性一致的等位基因频率变化，应用了Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）检验。此外，使用PoPoolation2流程中的fisher-test.pl脚本分别对每个种群进行Fisher精确检验。为了评估与显著SNP相关的基因的功能相关性，使用goseq包进行了Gene Ontology（GO）富集分析。
2.4 RNA测序与基因表达分析
在第一次CTmax试验和银化前约3周从每个个体采集非致死性鳃片，保存在RNAlater中。使用TRIzol试剂从组织样本中提取总RNA。DNase处理后的总RNA样本在干冰上运至Genome Quebec测序机构，使用Illumina HiSeq X PE150平台进行后续文库制备和测序。使用STAR将读数比对到奇努克鲑基因组。使用edgeR包进行基因水平读数计数和分析。使用goseq包进行基因本体（GO）富集分析。
3 结果
3.1 种群与生命阶段对耐热性的影响
我们比较了雄性和雌性之间的CTmax，发现在任何种群中，或在淡水或盐水中均无显著差异。因此，将所有后续分析的性别合并。
我们假设溪流型奇努克鲑由于在淡水中居住时间延长且暴露于极端温度的可能性增加，会表现出比海洋型种群更高的耐热性。然而，与这一预测相反，我们发现溪流型奇努克鲑的CTmax在淡水（银化前）和盐水（银化后）条件下均显著低于海洋型鲑鱼。在所有种群中，银化与CTmax的显著降低相关，表明与此过程相关的生理变化对热性能产生了负面影响。此外，这种降低的幅度因种群而异。我们还注意到淡水个体间CTmax的变异低于盐水，表明盐度可能影响耐热性的个体间变异程度。
由于个体在两个阶段均被PIT标记和跟踪，我们能够比较同一个体在银化前和银化后的CTmax，以评估淡水中的耐热性是否预测盐水中的耐热性。我们发现银化前和银化后CTmax之间仅存在弱相关。
我们注意到溪流型奇努克鲑比海洋型鱼年长1岁，因此体型更大。
3.2 热性能的全基因组关联
为了识别与耐热性相关的遗传变异，我们根据CTmax将每个种群的顶级和底层50个个体的DNA进行混合，旨在实现1:1的性别比例。用于排名个体的CTmax值是在淡水耐热性试验中测量的，以便与相同个体的转录组数据直接比较。在任何种群中，顶级和底层表现者之间的鱼体重和叉长没有统计学差异，并且池在大小和条件上具有可比性。
Poolseq数据的主成分分析（PCA）揭示了种群间清晰的遗传分化：前两个主成分解释了总变异的48.8%，主要按种群和生活史类型分离个体，表明种群间分化强于与耐热性相关的全基因组信号。值得注意的是，顶级和底层CTmax表现者之间的分化在PC4（9.8%）和PC5（8.5%）中变得明显，特别是在两个溪流型种群中。
为了识别跨种群与耐热性相关的位点，我们应用Cochran-Mantel-Haenszel（CMH）检验来检测高表现者和低表现者之间一致的等位基因频率差异。该分析识别出2454个p值 < 1×10?8的SNP，包括453个p值 < 1×10?10的SNP。这些SNP广泛分布在整个基因组中，没有在特定染色体或区域聚集的证据。p值最低的SNP位于4号染色体上LOC112246624的下游，靠近dnajc，这是Hsp40（DNAJ）家族的成员，已知在细胞热应激反应中起关键作用。对显著SNP附近基因的Gene Ontology（GO）富集分析确定了两个富集的过程：IRE1介导的未折叠蛋白反应和应对内质网应激的内在凋亡信号通路。这两个过程都涉及由内质网中未折叠蛋白积累触发的细胞应激反应，并与预期在增强耐热性选择下的通路一致。
Fisher精确检验应用于比较每个种群内高和低表现者之间的等位基因频率。溪流型种群（Ashlu中2502个；Shovelnose中18090个）比海洋型种群（Chehalis中322个；Chilliwack中90个）识别出更多显著SNP。没有SNP在所有四个种群中一致地与表现相关。这些结果与PCA中观察到的模式一致，在溪流型种群中表现组之间的分离更为明显。
在个体种群水平上对显著SNP附近基因进行基因本体富集分析，发现了跨奇努克鲑种群与耐热性相关的独特生物过程集合。虽然每个种群都表现出独特的富集术语谱，但一些共同主题是明显的。两个海洋型种群（Chilliwack和Chehalis）都显示出信号传导和运输过程的富集，包括细胞因子产生、钙调磷酸酶-NFAT信号级联和逆行囊泡运输。相比之下，溪流型种群（Ashlu和Shovelnose）显示出与转录、翻译和细胞应激反应相关过程的富集，包括应对ER应激的凋亡信号、突触功能、氧化应激反应和未折叠蛋白反应。应激相关通路在两种生活史中都有富集，尽管溪流型种群表现出与神经元信号和结构组织相关的更多样化的额外过程。这些模式表明种群特异性策略用于在热应激下维持细胞功能。
3.3 奇努克鲑热性能的RNA测序分析
RNA-seq数据的主成分分析（PCA）显示，样本主要按种群和生活史类型聚类，顶级和底层热表现者之间分离很小。PC1和PC2共同解释了总变异的41.88%。这些结果表明，转录本丰度的种群水平差异是数据集中的主要变异来源，而与表现相关的表达差异相对细微。
包括所有种群的差异表达分析识别出9个在顶级和底层表现者之间具有显著表达差异的基因。然而，人工检查显示平均表达差异通常由少量异常样本驱动。
为了减轻异常值的影响，我们比较了组间基因表达的四分位距（IQR），并根据IQR重叠程度对基因进行排名。三个基因（STARD7、ZNF711和TNFRSF3）在顶级和底层表现者之间表现出小于20%的IQR重叠，表明在大多数个体中存在一致的表达差异。
考虑到种群对基因表达谱的主导效应，我们接下来检查了每个种群内顶级和底层表现者之间的表达差异。PCA显示，表现组之间最强的分离发生在溪流型种群的第一主成分（PC1）上。在Shovelnose中，顶级和底层表现者沿PC1分离，解释了27.2%的变异，而Ashlu沿PC1表现出较弱但仍可见的分离（解释15.9%的变异）。相比之下，海洋型种群在PC1上显示很少或没有分离，仅在Chilliwack中在更高阶成分上观察到轻微分歧，在Chehalis中没有明显分离。这些结果表明与热性能相关的种群特异性转录组模式，即使在同一生活史类型内也是如此。
差异基因表达分析与这些PCA结果一致。在溪流型种群中检测到多个DEG（Ashlu：67个基因；Shovelnose：6625个基因），其中PCA显示沿主要主成分在顶级和底层表现者之间有更清晰的分离。相比之下，在PCA空间中显示很少分离的海洋型种群产生非常少的DEG（Chehalis：4个基因；Chilliwack：6个基因）。
对DEG的基因本体富集分析确定了几个可能与热性能相关的生物过程。在Shovelnose中，富集的术语包括蛋白质泛素化和通过剪接体的mRNA剪接。相比之下，在Ashlu、Chehalis或Chilliwack中没有识别出显著富集的GO术语。Ashlu中缺乏富集可能反映了个体间转录反应的更大异质性或当前功能注释的限制。同样，Chehalis和Chilliwack中有限数量的DEG可能限制了检测富集通路的能力，并与PCA中观察到的较弱分离一致。
为了探索在没有富集GO术语的种群中DEG的潜在生物学相关性，我们应用了四分位距（IQR）重叠过滤器来识别表现组之间具有一致表达差异的基因。该方法突出了其中央表达范围（第25-75百分位数）显示最小重叠的基因，减少了异常值的影响。在Ashlu，该过滤器识别出诸如lrsam1、IRE1α (LOC112214707)、dmgdh和HMG盒转录因子BBX (LOC112228428)等基因，所有这些都与应激反应、蛋白质调控或转录控制相关。
在Chehalis种群的四个DEG中，只有一个基因（CIAO1）表现出高和低表现者的四分位距重叠最小的表达模式。类似地，虽然在Chilliwack种群中识别出六个DEG，但大多数显示表达分布有大量重叠。具有最明显模式的两个基因包括一个在高表现者中表达更高且与ZNF574有部分同源性的基因，另一个（fstl1b; LOC112237012）在高表现者中表达较低。虽然海洋型种群的表达差异相对较小，但跨种群涉及的独特基因集合进一步强调了热性能反应中的转录组分歧。
3.4 CTmax在银化前和后的SNP关联
为了研究耐热性的基因组结构是否在银化后发生转变，我们对Shovelnose种群在淡水和盐水中分别进行了基因型-表型关联分析。银化前和银化后样本的汇集基因型数据的主成分分析（PCA）显示，第一主成分（PC1）解释了总变异的44.9%，将基于热性能的池分开，区分了顶级和底层表现者。第二主成分（PC2）解释了28.5%的变异，区分了银化前和银化后的池，反映了发育阶段的差异。
我们识别出1301个SNP在淡水中与顶级和底层表现者之间的CTmax差异显著相关，在盐水中有96,557个SNP显著相关。引人注目的是，这些集合之间重叠极小，只有199个SNP在环境间共享，表明 underlying 热耐性的基因组区域在很大程度上是特定于环境和发育阶段的。这种模式表明与银化相关的生理和环境转变 substantially 重塑了热性能的遗传基础。尽管具体位点存在分歧，功能注释揭示了在更高层次生物功能上的收敛。在两种环境中，我们都识别出与细胞保护、膜组织以及免疫或应激信号相关的基因。
为了进一步比较银化前和银化后阶段之间耐热性的基因组基础，我们检查了每个环境中显著SNP的染色体分布。与淡水和盐水中CTmax相关的SNP显示出 largely 不同的基因组分布，强化了银化重新配置热性能遗传结构的观点。值得注意的是，在银化后数据集中，我们在26号染色体上识别出一个显著的SNP簇。该簇中的几个基因在功能上与细胞应激反应和蛋白质稳态相关。
4 讨论
4.1 总体总结
本研究证明奇努克鲑的耐热性因种群和生活史策略而异，受银化生理需求以及淡水和海洋环境间过渡的影响。我们发现种群特异性遗传因素和发育阶段在塑造热恢复力中起关键作用，揭示了影响热性能的内在和外在因素之间的复杂相互作用。耐热性是变温动物生存、生长和分布的关键决定因素，在鲑科鱼类中，这一性状是由不同生命阶段遇到的对比温度和盐度条件所塑造的。通过研究银化时间的生活史变异和从淡水到盐水的生理转变如何影响不列颠哥伦比亚省南部奇努克鲑的耐热性，我们识别了与热性能相关的种群特异性遗传变异，反映了发育过程与环境条件之间的相互作用。这些结果突显了一种多基因的遗传结构，该结构随银化
