《Redox Biology》：Fibroblast
circSamd4 promotes cardiac fibrosis
via activating plasminogen activator inhibitor-1
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本研究揭示了成纤维细胞特异性高表达的环状RNA circSamd4在心脏纤维化中的关键作用。研究人员通过多组学筛选发现circSamd4在人和小鼠纤维化心脏中显著上调，进一步通过功能获得和功能缺失实验证明circSamd4通过吸附miR-1894-3p解除其对Serpine1(PAI-1)的抑制作用，从而促进心脏成纤维细胞活化。AAV介导的circSamd4或Serpine1敲低显著改善小鼠心脏纤维化和心功能不全，为心脏纤维化的治疗提供了新的潜在靶点。
心脏纤维化是多种心脏疾病共同的病理结局，也是导致心力衰竭的主要原因。然而，由于缺乏有效的药物治疗方法，心脏纤维化至今仍是心血管医学领域面临的重大挑战。在心脏纤维化过程中，心脏成纤维细胞的过度活化是最直接的驱动因素。近年来，环状RNA（circRNA）作为基因表达调控的关键分子，在心血管疾病中的作用日益受到关注，但其在心脏纤维化中的具体功能和机制尚不清楚。
在这项发表于《Redox Biology》的研究中，研究人员通过系统性筛选发现了一个在成纤维细胞中特异性高表达的环状RNA——circSamd4。该分子在人和小鼠的纤维化心脏组织中显著上调，且在TGF-β1激活的成纤维细胞中表达进一步增加。研究人员通过多种实验技术证实circSamd4是由Samd4基因的第三外显子反向剪接形成的环状RNA，长度为519个核苷酸，在人和小鼠之间具有高度保守性（约93%）。
为阐明circSamd4的功能，研究团队采用了AAV9介导的成纤维细胞特异性基因操作策略。实验结果表明，敲低circSamd4能够显著改善压力超负荷引起的小鼠心脏功能障碍，减轻心脏纤维化程度，降低纤维化标志物（Ccn2、Postn和Col1a1）的表达。相反，过表达circSamd4则会加重心脏纤维化表型。在细胞水平上，circSamd4的敲低抑制了成纤维细胞的增殖、迁移和活化能力，而过表达则产生相反效果。
机制研究发现，circSamd4主要定位于细胞质，可能通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制发挥作用。通过RNA测序和生物信息学分析，研究人员鉴定出miR-1894-3p是circSamd4的直接作用靶点，而Serpine1（编码PAI-1蛋白）则是miR-1894-3p的下游靶基因。双荧光素酶报告基因实验证实了circSamd4与miR-1894-3p、miR-1894-3p与Serpine1 3'UTR之间的直接结合关系。
进一步实验表明，circSamd4通过吸附miR-1894-3p解除其对Serpine1的抑制作用，从而促进PAI-1表达，驱动成纤维细胞活化和心脏纤维化进程。功能回复实验证实，miR-1894-3p过表达或Serpine1敲低能够逆转circSamd4过表达引起的成纤维细胞活化。动物实验也显示，成纤维细胞特异性敲低Serpine1能够缓解circSamd4过表达导致的心脏纤维化恶化。
本研究主要采用了以下关键技术方法：circRNA芯片筛选、RNA测序分析、AAV9介导的成纤维细胞特异性基因操作（使用Postn启动子）、原代心脏成纤维细胞分离培养、双荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down assay、免疫荧光染色、Edu细胞增殖检测、胶原凝胶收缩实验、细胞划痕实验以及小鼠胸主动脉缩窄（TAC）模型。
2.1. 人和小鼠心脏纤维化中circRNA的鉴定
通过circRNA芯片分析，研究人员发现在压力超负荷诱导的小鼠纤维化心脏中，mmu_circSlc8a1、mmu_circMyom2和mmu_circSamd4显著上调。进一步分析表明，circSamd4主要在成纤维细胞中表达，且在人和小鼠的纤维化心脏中均显著上调。细胞实验证实，TGF-β1处理可诱导circSamd4表达增加，且与成纤维细胞活化标志物（α-SMA、Postn、Ccn2）的表达呈正相关。
2.2. 成纤维细胞表达的circSamd4加重小鼠心脏纤维化
通过AAV9-Postn-sh-circSamd4介导的成纤维细胞特异性circSamd4敲低，研究人员发现这能够显著改善TAC引起的心脏功能障碍，减轻心脏肥大和纤维化程度。相反，成纤维细胞特异性过表达circSamd4则加重了心脏纤维化表型。这些结果表明circSamd4在心脏纤维化进程中发挥促进作用。
2.3. CircSamd4促进心脏成纤维细胞的增殖和活化
细胞水平实验表明，circSamd4敲低可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞活化标志物表达，降低细胞增殖、迁移和胶原收缩能力。而过表达circSamd4则进一步增强了TGF-β1诱导的成纤维细胞活化，表现为纤维化相关基因（FN1、CTGF、COL1A2、COL3A1和α-SMA）表达上调。
2.4. Serpine1是circSamd4下游效应因子，激活心脏成纤维细胞
RNA测序分析发现，circSamd4敲低主要影响纤溶酶原激活相关基因集，其中Serpine1（编码PAI-1）变化最为显著。实验证实circSamd4敲低可降低Serpine1表达，而过表达则产生相反效果。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验证实了circSamd4-miR-1894-3p-Serpine1调控轴的存在。
2.5. CircSamd4通过吸附miR-1894-3p调控心脏成纤维细胞中的Serpine1
研究发现miR-1894-3p在纤维化心脏和活化成纤维细胞中表达下调，而过表达miR-1894-3p可抑制成纤维细胞活化。机制上，circSamd4作为分子海绵吸附miR-1894-3p，解除其对Serpine1的抑制作用，从而促进成纤维细胞活化。
2.6. CircSamd4-miR-1894-3p-Serpine1轴促进成纤维细胞活化和心脏纤维化
功能实验表明，Serpine1敲低可抑制成纤维细胞活化，且能够逆转circSamd4过表达引起的效应。动物实验进一步证实，成纤维细胞特异性敲低Serpine1可缓解circSamd4过表达导致的心脏纤维化，表明Serpine1是circSamd4功能的关键下游效应因子。
本研究系统阐明了circSamd4在心脏纤维化中的重要作用及其分子机制。研究发现circSamd4通过ceRNA机制吸附miR-1894-3p，解除其对Serpine1的抑制，从而促进PAI-1表达，驱动心脏成纤维细胞活化和纤维化进程。这一circSamd4-miR-1894-3p-Serpine1调控轴的发现，不仅深化了对心脏纤维化发病机制的认识，也为临床治疗提供了新的潜在靶点。研究结果表明，靶向干预circSamd4或Serpine1可能成为治疗心脏纤维化的有效策略，具有重要的理论意义和临床转化价值。
