《Plant-Environment Interactions》：High-Throughput Screen of NPQ in Sorghum Shows Highly Polygenic Architecture of Photoprotection
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本研究通过高通量叶绿素荧光成像技术，对田间生长的861份高粱种质资源进行了为期两年的非光化学猝灭（NPQ）动力学性状筛选，揭示了高粱光保护性状具有中等至较高的广义遗传力（0.3-0.65）。研究结合全基因组关联分析（GWAS）和转录组关联分析（TWAS），鉴定出110个与NPQ变异相关的独特候选基因，这些基因展现出复杂的多基因遗传架构。该研究为解析C4作物光合效率的遗传基础提供了宝贵资源，并为通过育种或基因编辑手段改良作物光保护能力、应对气候变化挑战奠定了基础。
1 引言
全球农业生产力的增长很可能因预计的气候变异性增加而大幅减弱，而到205年，对粮食、饲料和生物燃料的需求预计将比2011年的水平增加47%的农业生产力。提高作物的光合效率被认为是一种潜在的缓解方案，有助于在不断变化的气候中维持生产力。非光化学猝灭（NPQ）是一种叶片生理过程，能够耗散过剩的吸收光能（光保护），是光合效率的重要决定因素。在C3阔叶作物中，NPQ的诱导和弛豫速率的提高已被证明能在田间条件下增加产量和生物量。光合和光保护性状的自然遗传变异作为作物改良资源具有巨大潜力，这些性状的变异已在作物和非作物种质资源中被发现。
高粱（Sorghum bicolor）作为世界范围内广泛种植的粮食和饲料作物，具有高水分利用效率和对抗逆胁迫的韧性，使其在日益不确定的气候条件下成为一种有吸引力的选项。高粱的适应性、相对较小的二倍体基因组（约730 Mb）和广泛的遗传多样性，便于在不同气候条件下进行高度可操作的变异研究。这些特性，加上高质量参考基因组的存在，使高粱成为理解关键C4光合性状（包括NPQ）中基因型与环境（GxE）互作的有力资源。
揭示高粱光保护自然变异的程度，并鉴定控制这种变异的基因，可以通过育种、基因组编辑和转基因方法促进种质改良。基因组和转录组范围的关联研究（GWAS和TWAS）可用于鉴定控制高度多基因光合性状的数量性状位点（QTL）和候选基因。尽管这两种方法已被证明有用，但它们都因需要设定适当的显著性阈值而变得复杂，该阈值需要在考虑多重并行检验的同时保持足够的严格性，并控制假阴性率。然而，由于两种方法中假阴性和假阳性的发生可以假设是独立的，结合GWAS和TWAS提供了一种检测与复杂作物生理性状相关的更高置信度QTL的方法。
2 材料与方法
2.1 种质与田间试验设计
一个由869个遗传多样性生物质高粱种质组成的群体（先前已有描述）在2017年和2019年于美国伊利诺伊大学厄巴纳附近的麦克斯韦农场（2017年）和能源农场（2019年）研究点种植。种质采用增广区组设计，960个四行区（行长3米）排列成40列24行，共16个区组。不完全区组通过六个共同对照种质连接，以在表型性状统计分析中考虑区组效应。本研究分别使用了2017年和2019年经过滤后拥有标记数据的855份和846份种质的数据，使得对861份种质进行联合年份分析成为可能。
2.2 田间取样
通过叶绿素荧光成像在两年中对高粱种质的光保护性状进行筛选。采样和筛选使用离体叶片圆片，通过96孔板法进行。在测量时，从最年轻的完全展开叶（以叶舌出现为标志）用6毫米直径打孔器取叶盘。每个小区中间两行的两株独立植株各取一个样品，每个种质共提供四个生物学重复。为防止种质间采样时间差异，按重复顺序对区组进行采样。因此，重复间的采样时间不同，但基因型间的平均采样时间差异保持在45分钟内（采样一个区组所需时间）。采集后，样品板用铝箔包裹以防止光线进入并缓冲温度变化，然后在完成进一步采样期间储存在冷却的聚苯乙烯容器中。每天对128个种质的四个重复进行采样，采样在当地时间14:30至18:30之间进行。所有每日采样完成后，板在约20°C的温控实验室中过夜储存。采样于2017年7月25日至28日和8月1日至4日，以及2019年7月22日至25日和7月28日至31日进行。
2.3 光保护性状的叶绿素荧光筛选
叶盘在采样后的早晨使用荧光成像仪进行成像。96孔板按照前一天下午采样的顺序进行成像，以减轻时间偏差。在光线昏暗的房间里，在成像前立即移除每个板上的箔，并将板放入成像仪。成像程序使用800毫秒长的闪光，光合光子通量密度（PPFD）为4000 μmol m-2s-1，包括暗适应下最大光系统II（PSII）量子效率（Fv/Fm）的测量，随后在2000 μmol m-2s-1有效光PPFD下10分钟内的周期性荧光测量，然后是12分钟的黑暗。在NPQ诱导（光照）期间，荧光参数在前20秒每20秒测量一次，然后在光照期剩余时间每分钟测量一次。在NPQ弛豫（黑暗）期间，荧光参数在黑暗期第一分钟每20秒测量一次，随后3分钟每分钟测量一次，然后在黑暗期剩余时间每3分钟测量一次。图像阈值处理和分割在MatLab中进行。每个叶盘的荧光值取叶盘像素值的中位数。检查叶盘的Fv/Fm值分布以识别异常叶片样本，并排除Fv/Fm值低于0.65的叶盘。
使用MatLab，将指数模型分别拟合到光诱导和暗弛豫期的NPQ轨迹，以便对NPQ诱导和弛豫速率以及PSII运行效率（Fq'/Fm'）的暗恢复进行定量比较。除了指数模型导出的参数外，还确定了光照期间达到的最大NPQ以及NPQ诱导/弛豫的初始线性斜率，并根据描述的方法计算了光保护指数（PI），描述了NPQ的光保护有效性。简而言之，PI是观察到的Fv/Fm（在给定PPFD下的最大PSII量子效率）与基于12分钟黑暗期结束时残余NPQ可预测的下降计算得到的最终Fv/Fm之间的比率。PI接近1表明相对于初始Fv/Fm的降低可完全归因于NPQ，而 progressively 低于1的值表明部分下降可归因于光抑制（由于反应中心损伤导致的Fv/Fm持续降低）。
2.4 统计建模与遗传力
对每个性状/年份组合，使用ASReml for R拟合剩余最大似然模型。此外，对两年数据进行了联合模型分析。计算了每个基因型的最佳线性无偏预测（BLUP），分别用于2017年、2019年和联合模型， resulting in data for 861 accessions to be used for genomic analysis. 计算了每个性状的广义遗传力（类似于广义遗传力）。基于联合分析BLUPs计算了复合多性状评分，用于对NPQ诱导斜率、NPQ弛豫斜率和光保护指数等性状进行联合分析。
2.5 全基因组关联分析
本研究中使用的基因型数据集先前已发表。简而言之，使用了869个种质的100,435个基因分型测序（GBS）单核苷酸多态性（SNP），并利用包含5,512,653个SNP和229个种质的全基因组重测序panel进行填充。在过滤掉次要等位基因计数小于20的SNP并修剪高连锁不平衡（LD）（r2> 0.9）的SNP后，使用Beagle 4.1进行填充。 resulting data sets had 450,074 (2017), 450,449 (2019), and 454,087 (joint analysis) SNPs that were used for GWAS. 在TASSEL 5中获取亲缘关系矩阵和五个主成分（PC）。使用GEMMA对每个性状/年份组合进行单变量和多变量GWAS，采用Q+K模型。
2.6 转录组范围关联分析
使用先前描述的229个高粱种质在受控环境生长的基因表达数据，分析与光保护性状的转录本丰度协方差。分别分析了茎尖生长点（GP）和第三叶基部（3L）组织的转录本丰度与每个光保护性状/年份组合的关系。在定位之前，使用概率估计表达残差（PEER）因子为每个组织计算了10个隐藏因子。还从先前的基因型数据计算了五个PC。最后，从每个组织集中移除了在少于一半个体系中表达的基因。在计算协变量和过滤后，使用先前的PEER因子和PC作为协变量，对每个NPQ性状和基因表达值分别拟合一般线性模型。
2.7 结合基因组和转录组范围的分析
使用GWAS和TWAS结果进行Fisher联合检验（FCT），以减少假阳性和假阴性的影响。对于每个性状/年份组合，将前10%的GWAS SNP（按p值）分配给最近的基因（按物理位置）。然后对组合的前GWAS和所有TWAS转录本运行FCT。
2.8 候选基因选择与研究
采用集成方法选择候选基因，这增加了确定与叶片生理性状（通常是高度多基因的）相关基因的统计功效。将位于前0.05% GWAS SNP的LD块内的基因以及每个TWAS和FCT分析中前1%的基因（按p值排名）分类为“顶级基因”。对每个性状进行了总共15项分析。将在超过三个独立分析中重叠的高粱基因的拟南芥直系同源物使用R包gProfiler2进行鉴定。对拟南芥基因列表通过rbioapi进行Panther统计富集分析。基于以下条件将高粱顶级基因视为光保护的候选基因：（1）在给定性状的八个或更多个体分析中被识别；（2）在10个或更多独立性状中被识别为顶级基因。此外，基于手动调查，将几个高粱顶级基因视为候选基因。对候选基因进行SIFT分析，以调查编码区SNP对蛋白质功能变异贡献的可能性。
3 结果
3.1 高粱遗传多样性中存在显著的光保护性状变异
采用高通量叶绿素荧光筛选方法，对田间生长的高粱群体中的光保护性状多样性进行了表征。通过施加强光处理 followed by a dark period，测量了每个高粱种质的NPQ诱导和弛豫动力学，从而在遗传多样的高粱群体中进行光保护能力的定量比较。在高粱种质中观察到NPQ性状存在显著变异。在最大NPQ、NPQ诱导速率常数、NPQ弛豫速率常数和Fv/Fm恢复速率常数方面，最低和最高种质之间的百分比差异分别为24%、115%、87%和63%。大多数测量的性状显示出中等偏高的广义遗传力，其观察到的变异由许多显著的小效应位点的复杂结构所支撑。
3.2 基因组和转录组范围分析揭示高粱光保护相关基因
利用2017年、2019年和联合年份（joint）模型的最佳线性无偏预测（BLUP）进行标记-性状关联（MTA）分析，以鉴定与光保护性状变异相关的高粱基因组区域。对于每个模型/年份组合，使用高粱SNP集（GWAS）和转录本表达数据（TWAS）进行MTA分析。将与前0.05%的GWAS SNP连锁不平衡（LD）的基因以及每个TWAS中前1%的基因（按Bonferroni校正的p值排名）作为“顶级”基因。此外，对与前10%的GWAS SNP连锁不平衡的基因及其相应的转录本表达水平进行了Fisher联合检验（FCT）分析，将与NPQ性状协方差的前1%基因（按Bonferroni校正的p值）作为顶级FCT结果。
采用基于交集的方法生成控制高粱光保护性状的候选基因列表。例如，对于最大NPQ这一性状，联合模型GWAS鉴定出四个FDR校正p值低于0.05的SNP，覆盖不到20千碱基的区域，位于两个包含74个基因的LD块内。当与联合分析的TWAS结果结合时，GP和3L组织中的FCT检验加强了与该区域的关联，该区域的几个基因构成了分析中置信度最高的基因之一。该区域在CT1（最大NPQ、NPQ诱导幅度以及NPQ诱导和弛豫速率常数k的多变量组合）的联合FCT中也高度富集。许多顶级基因在多个联合模型最大NPQ分析中重叠，有5个基因在三个独立分析中重叠，93个基因在两个独立分析中重叠。将在单个性状的八个或更多模型分析中重叠的70个基因，根据总重叠数被视为置信度 progressively 更高的候选基因。将在九个或更多分析中重叠的16个基因总结在表中。
许多顶级基因是多个性状所共有的，近30%的顶级基因与三个或更多性状的顶级基因列表重叠。在10个或更多性状中重叠的37个基因被视为候选基因。多模型/单性状和多性状重叠阈值共同产生了104个独特的候选基因。另外六个独特基因基于与三个或更多性状的重叠关联，并且被TAIR注释为光响应相关功能或被注释为类胡萝卜素生物合成前体，而被记录为候选基因。
4 讨论
4.1 高粱基因组表现出广泛且可遗传的NPQ能力
在本高粱群体中观察到的光保护性状变异，增加了越来越多的证据，表明C4作物种内存在显著的光保护能力变异。尽管NPQ像许多光合性状一样具有发育和环境可塑性，但本研究和其它研究中发现的最大NPQ以及诱导和弛豫速率常数的中等到高遗传力水平，以及不同年份之间的显著相关性，促进了使用GWAS和TWAS来确定潜在的因果基因。
4.2 与胁迫响应和光合控制相关的基因新发现与NPQ性状相关
为了增加鉴定可能在高粱光保护中起控制作用的基因位点的置信度，我们采用了结合GWAS、TWAS和FCT分析以及利用荧光参数间协方差的集成方法。在给定性状的八个或更多分析中重叠，或在11个或更多性状中被识别为顶级基因的基因被视为候选基因。几个候选基因是拟南芥中注释为光利用或光合作用相关过程的直系同源基因。对候选基因编码区SNP的SIFT分析显示，99个候选基因中至少含有一个预测的非同义替换，这为观察到的标记-性状关联提供了一个潜在的因果机制。
5 结论
本研究利用迄今为止最大的田间生长多样性群体，表征了高粱光保护性状的可遗传变异程度。结果突出了该物种光保护遗传控制的复杂性，与荧光参数相关的大量显著的小效应位点。通过结合GWAS和TWAS并利用荧光参数间协方差的集成方法，鉴定出几个新的高置信度候选基因，这些基因可能对光合作用和光保护施加遗传控制。这些信息可用于通过突变体或基因改造研究指导进一步的靶向实验，以操纵高粱中的NPQ，并且如果与适当的标记开发相结合，可能用于标记或基因组辅助育种，以提高高粱和相关C4作物的光合效率。
