《Plant, Cell & Environment》：Protoplast-Based Functional Genomics and Genome Editing: Progress, Challenges and Applications
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本综述系统分析了1050篇文献，阐述了原生质体作为单细胞平台在植物功能基因组学、基因组编辑和抗逆育种中的前沿应用。文章重点介绍了原生质体在CRISPR/Cas核糖核蛋白（RNP）编辑、单细胞转录组学（scRNA-seq）以及体细胞杂交等方面的技术优势，特别是其能够实现无DNA、无转基因的精准编辑，为培育抗病、抗逆作物提供了高效合规的新策略。
原生质体技术：连接基础研究与作物改良的桥梁
原生质体，即去除细胞壁的植物细胞，为植物生物学研究提供了一个独特而强大的单细胞操作平台。这一系统能够高效地递送蛋白质、DNA、RNA及核糖核蛋白（RNP）等分子，使其成为在单细胞水平上进行功能基因组学、基因组编辑和信号转导研究的理想工具。
元分析揭示全球应用格局
通过对1050篇已发表研究的系统分析，发现原生质体瞬时表达系统应用广泛，涉及234个植物物种。其中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、玉米（Zea mays）等模式植物占据主导地位。质粒递送仍是最常用的方法，但基于CRISPR的基因组编辑，特别是DNA-free的RNP递送，正迅速兴起。研究目的主要集中在转染、分离、转化和融合等方面，并且多数研究聚焦于生物胁迫响应。叶肉细胞是最常见的原生质体来源，体现了该技术在叶片相关研究中的成熟度。
单细胞转录组学的赋能平台
原生质体在植物单细胞RNA测序（scRNA-seq）中的应用是一项突破性进展。它克服了植物细胞壁带来的细胞分离难题，使得研究人员能够以前所未有的分辨率解析植物组织的转录组景观。该技术已被成功应用于揭示细胞命运转变、组织分化过程以及胁迫响应背后的动态基因调控网络，尤其为研究传统成像技术难以企及的径向发育（如维管形成层活动）提供了新的视角。
应对育种挑战的技术方案
传统杂交育种在组合优良性状时面临生殖障碍、基因组高度杂合、世代周期长等挑战。原生质体技术提供了多种解决方案：
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体细胞杂交：通过原生质体融合，可以克服远缘物种间的有性不亲和障碍，将野生近缘种的有益性状（如抗病、抗逆）引入栽培作物。例如，柑橘品种‘G1 + HBP’通过原生质体融合获得了胞质雄性不育（CMS）特性；小麦品种‘山融3号’通过体细胞杂交导入了长穗偃麦草（Thinopyrum elongatum）的染色体片段，增强了耐盐性。
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精准基因组编辑：基于PEG/Ca2+介导的化学转染，可将CRISPR/Cas RNP复合体直接导入原生质体，实现精准的基因敲除或敲入。这种方法效率高，能避免嵌合体，且不遗留外源DNA，有助于满足监管要求。例如，在土豆（S. tuberosum）中编辑StEDS1和StPAD4基因可增强对病原真菌的抗性；在柑橘中编辑CsLOB1基因可获得抗溃疡病的再生植株。
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快速功能分析：原生质体可作为高通量筛选平台，快速测试基因表达构建体、启动子活性、蛋白质亚细胞定位及蛋白质-蛋白质相互作用，大大缩短了功能验证的时间。
技术挑战与未来展望
尽管前景广阔，原生质体技术仍面临一些关键挑战。首先，同源定向修复（HDR）介导的精准基因敲入效率仍然较低，优化细胞周期同步化和保护长链供体DNA的完整性是提高效率的关键。其次，原生质体的再生效率高度依赖于物种和基因型，是限制其推广的主要瓶颈。未来研究需要深入理解控制细胞全能性和再生的分子机制，并优化培养条件。最后，建立高效、稳定的原生质体遗传转化体系，对于需要长期表达外源基因的应用至关重要。
结语
总而言之，原生质体平台凭借其单细胞分辨率、高效递送能力和避免转基因残留等优势，正在植物功能基因组学、抗逆机制解析和作物精准育种中发挥着不可或替代的作用。随着单细胞多组学、递送技术和再生体系的进一步发展，原生质体技术有望在应对全球粮食安全挑战和加速作物改良进程中扮演更为关键的角色。
