两种分化的白粉病效应子决定小麦Pm4激酶融合蛋白抗性的毒性机制

《Nature Plants》：Virulence on Pm4 kinase-based resistance is determined by two divergent wheat powdery mildew effectors

本文揭示了小麦白粉病菌通过两个分化的效应子AvrPm4和SvrPm4调控基于Pm4激酶抗性的新机制。研究发现AvrPm4（Bgt-55142）可直接被Pm4识别并发生磷酸化，而RNase类效应子SvrPm4（Bgt-51526）能特异性抑制该免疫反应。值得注意的是，活性抑制因子SvrPm4JIW2同时可被NLR免疫受体Pm1a识别，这为理解真菌效应子的多重功能及设计多重抗病育种策略提供了新视角。

　　

白粉病菌对Pm4激酶抗性的毒性由两个分化的效应子决定

摘要

小麦抗病基因Pm4编码一种激酶融合蛋白（KFP），因其能够同时赋予小麦对白粉病和瘟病的种族特异性抗性而备受关注。本研究通过紫外诱变技术鉴定了被Pm4识别的白粉病菌无毒效应子AvrPm4，并在小麦原生质体中进行了功能验证。研究证明AvrPm4可直接与Pm4相互作用并被其磷酸化。通过遗传关联和数量性状基因座（QTL）定位，进一步发现毒性菌株逃避Pm4抗性依赖于第二个真菌组分SvrPm4，该因子能够抑制AvrPm4诱导的细胞死亡。令人惊讶的是，SvrPm4此前曾被报道为AvrPm1a。研究表明，活性形式的SvrPm4（而非其失活变体svrPm4）可被核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）免疫受体Pm1a识别。单一效应子的多重功能为理解真菌毒性蛋白及其与不同类型免疫受体的组合互作提供了新视角。

主要发现

白粉病菌获得对Pm4a和Pm4b毒性的突变体在一个新型效应子基因中表现出突变

为鉴定被Pm4识别的B. g. tritici效应子，研究采用基于紫外诱变的AvrXpose方法，对参考菌株CHE_96224（对含Pm4a或Pm4b的近等基因系无毒）进行诱变。获得了六个对两个Pm4等位基因均获得毒性的突变体（以下简称AvrPm4突变体）。全基因组测序显示所有六个AvrPm4突变体在效应子基因Bgt-55142的编码序列中均存在突变。这是所有六个AvrPm4突变体中唯一共同发生突变的基因，表明Bgt-55142即为AvrPm4。

Bgt-55142在吸器阶段高表达，编码一个含有信号肽和氨基末端预测为RNase样结构的蛋白质，包括特征性的YxC基序和所有已知B. g. triticiAvr蛋白中保守的内含子位置。然而，它与典型的白粉病菌Avr不同，长度更大（372个氨基酸），并含有一个羧基末端结构域。基于NCBI保守结构域搜索，该结构域与MED15结构域、EBNA-3B结构域和104-kDa microneme/rhoptry抗原结构域具有序列相似性。研究者将该结构域重新命名为MEA结构域。该域包含五个重复序列以及一个预测的核定位信号（NLS）。软件DP-bind预测表明Bgt-55142，尤其是在其MEA结构域，具有较高的DNA结合概率。

有趣的是，小麦瘟病效应子AVR-Rmg8（被Pm4/Rmg8识别）的序列与Bgt-55142的MEA结构域部分区域具有高度氨基酸同一性，一个八氨基酸的甘氨酸和脯氨酸富集基序（RGPGGPPP）在两个效应子中完全一致。

Bgt-55142⁹⁶²²⁴的表达在小麦原生质体中诱导细胞死亡

为验证Bgt-55142为AvrPm4，研究在小麦原生质体中进行细胞死亡实验。将无毒形式Bgt-55142⁹⁶²²⁴和两个突变形式Bgt-55142^4AB-6、Bgt-55142^4AB-2的基因序列（去除信号肽并进行植物密码子优化）与YFP报告基因共转染到稳定表达Pm4b-V1和Pm4b-V2的转基因小麦品系Bobwhite S26的原生质体中。结果发现，在Pm4b过表达品系中，与AVR-Rmg8和Bgt-55142⁹⁶²²⁴共表达时，相对YFP荧光显著降低，而在不含Pm4b的姊妹系中则无此现象。相反，两个Bgt-55142突变等位基因以及阴性对照AvrPm3^a2/f2和AvrSr50均未引起荧光降低。这表明Bgt-55142⁹⁶²²⁴（现称为AvrPm4⁹⁶²²⁴）以Pm4b依赖性方式被识别并触发细胞死亡。进一步实验证实，共转染Pm4b-V1和Pm4b-V2与AvrPm4⁹⁶²²⁴可导致荧光强度显著降低。但在本氏烟中共表达AvrPm4⁹⁶²²⁴与Pm4未引发细胞死亡，表明触发Pm4介导的免疫可能需要小麦中存在而本氏烟中缺乏的额外遗传组分。

Pm4直接与AvrPm4互作，导致其定位于内质网网络

分裂荧光素酶实验表明，AvrPm4⁹⁶²²⁴和截短的avrPm4^4AB-2均能与Pm4b的两种异构体Pm4b-V1和Pm4b-V2相互作用。但毒性变体avrPm4^4AB-2也能与Pm4相互作用，表明互作本身不足以触发免疫反应。

亚细胞定位显示，mTurquoise–AvrPm4⁹⁶²²⁴与mCherry–Pm4b-V1在细胞质中共定位，而与Venus–Pm4b-V2共表达时，AvrPm4⁹⁶²²⁴被重新定位至内质网（ER）网络。这为两种Pm4b异构体与AvrPm4⁹⁶²²⁴之间的相互作用提供了额外证据。

Pm4具有激酶活性并可磷酸化AvrPm4

体外激酶实验显示，纯化的Pm4b-V1和Pm4b-V2ΔTMD（缺失跨膜结构域的截短版本）均具有自体磷酸化和转磷酸化活性。含有仅激酶结构域（外显子1-5，缺少C2结构域）的截短构建体则无激酶活性，表明Pm4b-V1中的C2C结构域和Pm4b-V2中的C2D结构域对激酶活性是必需的。之前鉴定的两个影响激酶结构域保守基序的功能丧失突变（催化环中的D170N替换和激活环中的D188N替换）强烈降低或完全消除了激酶活性，表明Pm4激酶活性与抗性相关。

研究进一步评估了等位基因Pm4a、Pm4f和Pm4g编码蛋白的激酶活性。具有抗病活性的Pm4a和Pm4f异构体表现出与Pm4b相当的自身和转磷酸化活性，而无功能的Pm4g等位基因则未检测到激酶活性，这支持了激酶活性对Pm4抗病功能至关重要的假设。

重要的是，体外磷酸化实验表明，AvrPm4⁹⁶²²⁴可被Pm4b-V1和Pm4b-V2ΔTMD磷酸化，而激酶失活突变体Pm4b-V1(D188N)则不能。出乎意料的是，尽管不能触发细胞死亡，毒性变体avrPm4^4AB-2也能被两种Pm4异构体磷酸化。这些结果证实了AvrPm4–Pm4在体外的相互作用，但也表明仅Avr的磷酸化不足以触发免疫反应。

白粉病菌对Pm4的毒性由8号染色体上的一个抑制因子位点控制

对78个B. g. tritici分离株在Pm4b和Pm4a近等基因系（NILs）上的毒性表型分析显示，大多数分离株在两个Pm4等位基因上具有相同的毒性表型。AvrPm4在所有测试分离株中均存在，且序列高度保守。然而，AvrPm4基因型与在Pm4b和Pm4aNILs上的毒性表型无关。可用的RNA测序数据集分析也显示，在具有相反Pm4表型的B. g. tritici分离株（如无毒菌株CHE_96224, CHE_94202, ISR_7与毒性菌株GBR_JIW2）之间，AvrPm4表达没有显著变异。这些观察表明，除了AvrPm4之外，还有其他遗传成分控制对Pm4的毒性。

为鉴定这些额外成分，研究采用了全基因组关联分析（GWAS）和双亲QTL定位两种独立方法。GWAS分析揭示了在Pm4b上，8号染色体末端存在一个显著的遗传关联，4号染色体开头有一个较弱的关联。在Pm4a上的GWAS分析则发现8号染色体上存在一个单一的显著遗传关联，与在Pm4b上鉴定的位点重叠。

QTL定位使用无毒菌株CHE_96224和部分毒性菌株THUN-12（对Pm4a部分毒性，对Pm4b无毒）的F₁后代群体进行。在Pm4aNIL上的QTL分析鉴定出8号染色体上一个单一的QTL，与GWAS分析中检测到的位点重叠。

值得注意的是，GWAS和QTL定位均未在5号染色体的AvrPm4基因处发现显著遗传关联。相反，两种互补的方法提供了强有力的证据，表明8号染色体上存在一个主要的遗传成分，控制B. g. tritici对Pm4b和Pm4a抗性等位基因的毒性。鉴于AvrPm4的功能丧失突变本身就足以导致对Pm4b和Pm4a的毒性，研究者假设该区域包含一个无毒性的抑制因子（SvrPm4），它干扰了AvrPm4被Pm4识别。

SvrPm4(Bgt-51526^JIW2) 抑制AvrPm4/Pm4诱导的小麦原生质体细胞死亡

研究者在CHE_96224菌株8号染色体上鉴定的区间内，基于GWAS分析和预测的信号肽，确定了三个候选抑制因子基因：Bgt-51526、BgtAcSP-30824和BgtAcSP-31023。表达分析显示在具有不同Pm4b和Pm4a表型的参考菌株间无主要表达多态性。因此聚焦于无毒和毒性参考菌株之间的序列多态性。效应蛋白Bgt-51526^JIW2与Bgt-51526⁹⁶²²⁴有27个氨基酸差异，而BgtAcSP-31023^JIW2则有两个氨基酸多态性和一个提前终止密码子。

小麦原生质体实验表明，单独表达这些SvrPm4候选基因均不会在Pm4转基因系中触发细胞死亡。然而，将Bgt-51526^JIW2与AvrPm4共表达可显著降低细胞死亡反应，而Bgt-51526⁹⁶²²⁴或两种BgtAcSP-31023变体均未检测到抑制效应。因此得出结论，Bgt-51526^JIW2（此后称为SvrPm4^JIW2）确实是Pm4介导的细胞死亡的抑制因子，而Bgt-51526⁹⁶²²⁴（svrPm4⁹⁶²²⁴）则无抑制能力。

在78个测试的B. g. tritici分离株中，SvrPm4基因存在广泛的序列变异，鉴定出10个高度多态的单倍型变体。重要的是，所有携带无活性变体svrPm4⁹⁶²²⁴的分离株在Pm4b和Pm4a上均表现无毒表型，而所有携带SvrPm4^JIW2的分离株对两个Pm4等位基因均有毒性，突出了SvrPm4在克服Pm4抗性中的重要性。

活性抑制因子SvrPm4^JIW2而非svrPm4⁹⁶²²⁴可被小麦NLR Pm1a识别

基因Bgt-51526(SvrPm4)编码一个RNase样效应蛋白，此前已被鉴定为被小麦抗病基因Pm1a编码的NLR免疫受体识别的Avr。为确定SvrPm4^JIW2和此前未描述的svrPm4⁹⁶²²⁴变体是否诱导不同的HR反应，研究在本氏烟中共表达每个变体与Pm1a。结果一致表明，共表达SvrPm4^JIW2和Pm1a可引发强烈的HR反应，确认了该变体对Pm1a的无毒活性。而共表达svrPm4⁹⁶²²⁴和Pm1a未导致HR反应。因此，SvrPm4^JIW2同时是Pm4的活性抑制因子和Pm1a的Avr因子，而无活性的抑制因子svrPm4⁹⁶²²⁴则逃避了Pm1a的识别。

讨论

对Pm4的无毒性由B. g. tritici中的至少两个基因控制。AvrPm4是一个无毒因子，其破坏导致对Pm4a和Pm4b的毒性。此外，AvrPm4触发的免疫被SvrPm4抑制。这种多组分系统通过结合紫外诱变、GWAS和QTL映射得以揭示。

此前鉴定的B. g. triticiAvr效应子是小的RNase样效应子，被NLR受体识别。与之相反，被KFP Pm4识别的AvrPm4是一个372个氨基酸的嵌合蛋白，具有N端RNase样结构域和C端MEA结构域，与之前鉴定的B. g. triticiAvr蛋白有显著不同。AvrPm4的MEA结构域与转录调控相关蛋白具有序列相似性，并具有预测的NLS和高DNA结合概率，提示其可能在宿主转录操纵中发挥作用。

Avr效应子的突变或丢失是真菌植物病原体逃避R基因介导免疫的常见机制。然而，具有关键毒力功能的Avr效应子的丢失可能导致病原体适应性降低。因此，多种真菌植物病原体分泌抑制蛋白来掩盖Avr效应子或抑制NLR介导的免疫，从而保留重要的Avr效应子。本研究发现RNase样效应子SvrPm4能够抑制KFP免疫受体的识别，突出了这类效应子分子活性的多样性及其作为种族特异性抗性抑制因子的重要性。

GWAS和QTL分析表明，SvrPm4是自然B. g. tritici群体中控制对Pm4a和Pm4b毒性的主要因子。SvrPm4基因的多样性表明可能存在其他活性抑制变体或仅靶向部分Pm4等位基因的变体，这可能解释了不同Pm4等位基因识别谱的细微差异。

有趣的发现是，活性抑制因子变体SvrPm4^JIW2可触发Pm1a介导的HR，而无活性变体svrPm4⁹⁶²²⁴则逃避识别。这表明将Pm4和Pm1a组合在同一小麦基因型中可提供互补的抗性活性。通过将Pm4和Pm1a结合，可能实现对这一效应子的有效 disruptive 选择压力，这为实现针对B. g. tritici的持久抗性提供了一种有前景的策略。

Pm4基因发生可变剪接，产生两种异构体Pm4-V1和Pm4-V2，两者均对抗病是必需的。研究表明AvrPm4与两种异构体相互作用，并且与Pm4b-V2共表达时被重新定位至ER膜。此外，有证据表明两种Pm4异构体具有自身和转磷酸化活性，可导致AvrPm4磷酸化。激酶活性对抗病的重要性进一步得到证实，因为所有具有 documented 抗病活性的Pm4等位基因（Pm4a, Pm4b, Pm4f）均表现出激酶活性，而无功能的Pm4g等位基因则没有。值得注意的是，毒性变体avrPm4^4AB-2也能被磷酸化，表明仅AvrPm4磷酸化不足以决定细胞死亡的启动。

最近研究发现小麦KFPs Sr62和WTK3依赖一个NLR蛋白来诱导HR。与本发现一致，在异源本氏烟系统中共表达Pm4和AvrPm4未能触发HR，表明Pm4可能像其他KFPs一样，依赖另一个宿主蛋白（可能是一个在小麦基因库中保守的执行NLR）来诱导细胞死亡。鉴定这一未知组分应是未来研究的重点。

随着在白粉病和小麦瘟病中鉴定和表征的R/Avr对的快速增加，一个涉及抑制因子、修饰因子和额外抗病基因的复杂分子网络正在被揭示。本研究发现的AvrPm4和SvrPm4在调控Pm4抗性中的核心作用，以及SvrPm4被Pm1a识别的交叉反应，凸显了R-Avr分子网络的复杂性。总之，该研究主张从单基因策略转向抗病基因叠加，将基于激酶的受体（如Pm4）与NLRs（如Pm1a）相结合，并倡导联合抗白粉病和瘟病的小麦育种计划，以有效利用抗性源之间的重叠和协同效应，从而实现多层且可能更持久的病原体抗性。