《Sensors and Actuators B: Chemical》：Multiplex on-site detection of porcine diarrheal viruses via a quantum dot microspheres-based RT-RAA-CRISPR lateral flow platform
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本研究开发了一种集成RT-RAA、CRISPR/Cas12a和量子点微球的快速现场诊断平台，用于同时检测PEDV、PDCoV和PoRVA，具有高灵敏度（1 copy/μL）、特异性及稳定性，适用于资源有限地区。
赵一然|李家豪|季志润|张楚涵|王帅|李鹏|毛瑞琦|陈婷轩|单彦凯|吴明辉|刘飞
南京农业大学三亚研究院，中国三亚572000
摘要
由猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪A组轮状病毒（PoRVA）等病毒病原体引起的猪腹泻给全球养猪业造成了巨大的经济损失。快速、准确且可在现场应用的检测方法对于早期诊断和及时干预疫情至关重要，尤其是在资源有限的情况下。在这项研究中，我们开发了一种集成式的即时检测平台，结合了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）、CRISPR/Cas12a介导的核酸检测以及基于量子点微球（QDMs）的荧光并行侧向流动检测技术，用于多重检测PEDV、PDCoV和PoRVA。此外，还配备了一个与智能手机兼容的便携式荧光读取器，以实现现场应用的定量分析。该系统能够在1小时内完成检测，检测限（LOD）低至1拷贝/μL。该系统表现出优异的特异性，不会与其他测试的病毒病原体（包括ASFV、CSFV、TGEV、PRRSV、SADS-CoV和BRV）发生交叉反应，并且在37℃下储存一个月后仍能保持稳定的性能。通过模拟样本、混合感染样本和临床样本的验证，该系统与传统的RT-qPCR检测方法的结果完全一致。这一新型平台为猪病毒性腹泻的现场监测和早期诊断提供了一种快速、超灵敏、稳定且用户友好的解决方案，为养猪业的疾病监测和控制提供了有效工具。
引言
腹泻是猪最常见的疾病之一，严重影响其生长发育。这种状况会延长繁殖周期、降低饲料利用率、延迟屠宰时间，并导致高死亡率，给农民带来巨大的经济损失[1]。猪腹泻的病因复杂，其中病毒感染是最严重的原因[2]。主要导致猪腹泻的病毒包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）和猪轮状病毒（PoRV）[3]、[4]、[5]。在PoRV株中，猪A组轮状病毒（PoRVA）通常是与仔猪腹泻疾病最相关的亚型[6]。PEDV、PDCoV和PoRVA都会引起类似的临床症状，如呕吐、腹泻和脱水[7]、[8]、[9]。猪病毒性腹泻对新生仔猪尤其有害，高死亡率会导致养猪企业无法挽回的经济损失。更严重的是，PDCoV和PoRVA具有跨物种传播的风险，对人类和动物健康构成重大威胁，被公认为全球公共卫生问题[10]、[11]。养猪业的迅速扩张增加了人与猪的接触，从而增加了跨物种传播的可能性，使得疫情预防和控制的难度加大。猪病毒性腹泻引起的临床症状和病理变化非常相似，使得鉴别诊断具有挑战性[12]，在临床实践中很难区分这些病原体。此外，不同腹泻病毒的混合感染也很常见，进一步复杂化了诊断和预防工作[13]。因此，开发一种新型的、快速的、准确的多重检测方法对于这些导致猪腹泻的病毒病原体的鉴别诊断至关重要。
目前，已经有多种检测方法用于猪腹泻病毒的诊断，主要分为血清学方法和分子生物学技术。血清学方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]、[15]和免疫层析[16]、[17]、[18]，成本低廉、操作简单、检测速度快，适合大规模样本筛查。然而，这些方法的灵敏度和特异性通常较低。由于猪腹泻病毒主要影响哺乳期仔猪[19]，而它们的免疫系统尚未成熟，因此从这些动物身上采集血液样本具有挑战性，从而限制了血清学方法在这些情况下的应用。相比之下，分子诊断方法更适合检测猪腹泻病毒。传统的聚合酶链反应（PCR）[20]和实时定量PCR（RT-qPCR）[21]已被开发用于检测PEDV、PDCoV和PoRVA，在灵敏度和特异性方面取得了显著改进。然而，这些方法需要复杂的实验室设施、昂贵的设备和复杂的操作程序，这阻碍了其在现场快速检测中的应用，尤其是在资源有限或偏远地区。因此，迫切需要
开发一种快速、灵敏、易于使用且可在现场应用的诊断平台，能够同时检测多种猪腹泻病毒。这样的平台对于资源匮乏地区的小规模养猪场尤为重要，可以实现早期诊断和及时干预疫情。近年来，基于智能手机的生物传感器因其便携性、实时性能和用户友好的操作而成为强大的即时检测工具[22]。智能手机体积小、便于携带、易于使用，可以实现实时监测[23]、样本检测、图像分析和数据传输，其微型化的检测系统相比传统仪器成本更低、响应更快、部署更加灵活[24]、[25]。它们的广泛可用性和多功能性推动了在研究和动物疾病诊断中的应用，使智能手机成为即时检测技术的关键推动者[26]。
近年来，基于CRISPR的诊断系统作为一种快速高效的核酸检测方法应运而生[27]。这些系统通过将CRISPR RNA（crRNA）与目标DNA配对，激活CRISPR蛋白的转切割活性，从而在非目标单链RNA或DNA序列上诱导任意的内切酶活性[28]。为了进一步提高检测的灵敏度和特异性，CRISPR系统通常与等温扩增技术结合使用[29]。等温扩增技术能够在恒定温度下快速高效地扩增核酸，无需昂贵的热循环仪，使其成为PCR的理想替代方案[30]。在等温扩增方法中，重组酶辅助扩增（RAA）因其简单的引物设计、快速的反应速度、在相对较低温度（37-42°C）下的高效扩增以及高特异性而得到广泛应用[31]。值得注意的是，RAA的反应温度与CRISPR系统的最佳工作温度高度兼容，使得两种技术可以无缝集成。这种耦合促进了快速等温扩增和高特异性目标识别之间的协同效应，显著提高了检测的灵敏度，并增强了其在即时检测应用中的实用性[33]。为了进一步提高灵敏度并实现定量分析，将量子点（QD）标记技术应用于侧向流动免疫层析检测中以增强荧光信号。量子点微球（QDMs）具有多种有利特性，包括高荧光强度、窄发射光谱、宽激发范围、良好的光稳定性以及良好的生物相容性[34]、[35]，这些特性共同有助于减少视觉解释的错误并简化结果分析[36]。
在这项研究中，我们开发了一种集成式的即时检测平台，结合了逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）、CRISPR-Cas12a和基于量子点的侧向流动条带，通过并行检测方法实现对三种主要猪腹泻病毒（PEDV、PDCoV和PoRVA）的超灵敏和现场检测。此外，还设计了一种便携式智能手机荧光读取器，以实现三种目标病毒的视觉和定量检测。在检测过程中，首先通过RT-RAA扩增目标核酸以生成足够的DNA模板，然后CRISPR-Cas12a特异性识别并切割目标序列。随后，将切割产物与稀释缓冲液混合后应用于基于QDMs的侧向流动条带。最后，通过便携式读取器收集荧光信号，并通过智能手机应用程序进行病毒载量的定量分析。整个检测过程在1小时内完成，灵敏度和特异性很高，检测限低至1拷贝/μL。总之，该系统成本低廉、操作简便，具有出色的分析性能，在资源有限的场合（如养猪场）具有巨大的应用前景。
材料与试剂
阳性标准质粒由General Bio Co., Ltd.（中国滁州）根据NCBI GenBank数据库中公布的PEDV（GenBank: MH107321.1）的N基因、PDCoV（GenBank: MG832584.1）的N基因和PoRVA（GenBank: MT784815.1）的VP6基因序列合成。非洲猪瘟病毒（ASFV）的核酸提取物由哈尔滨兽医研究所提供。经典猪瘟病毒（CSFV）和传染性胃肠炎的核酸提取物
基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的量子点荧光条带检测原理
基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的量子点荧光条带检测原理如图1所示。首先，在40℃的等温条件下使用RT-RAA试剂盒扩增目标核酸20分钟。然后将扩增产物与Cas12a、crRNA和报告探针混合。crRNA特异性识别并结合目标DNA，激活Cas12a的转切割活性，从而切割报告探针
结论
本研究开发了一种简化且快速的视觉检测方法，用于猪腹泻病毒的检测，为传统的多重RT-PCR检测方法提供了有效的替代方案。通过结合等温扩增、基于CRISPR/Cas12a的目标识别和基于量子点的荧光侧向流动检测，所开发的系统克服了传统核酸检测方法的局限性，简化了操作流程，并保持了高灵敏度和特异性。
作者贡献声明
赵一然：撰写——原始草案、验证、软件开发、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。刘飞：撰写——审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金争取、概念化。吴明辉：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金争取、概念化。单彦凯：项目监督、软件开发。陈婷轩：撰写——审稿与编辑。毛瑞琦：软件开发。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1800501）、中央高校基本科研业务费（090-ZJ25195024）、国家自然科学基金（22304071）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（SJCX25_0281）的支持。
赵一然（第一作者）目前在中国南京农业大学兽医学院攻读博士学位。她的研究重点是分子诊断技术，包括等温核酸扩增、基于CRISPR的生物传感技术和量子点荧光检测技术，用于快速灵敏地检测动物病原体。她参与了多个关于猪病毒性疾病即时检测系统的项目。她的工作旨在开发
