利用表面等离子体共振增强拉曼（Surface Plasmon Resonance Enhanced Raman, SPPRESR）系统对蛋白质复合物进行逐层表征——以肝素-血小板因子IV（Heparin-Platelet Factor IV, HPFIV）复合物的检测为例

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Layer-by-Layer Characterizations of Protein Complexes by Surface Plasmon Resonance Enhanced Raman System - Detection of Heparin-Platelet Factor IV Complexes as an Example

表面等离子体共振（SPR）增强拉曼检测平台通过Kretschmann配置实现纳米级分子识别，灵敏度达1 ng/mL，较传统方法提升50倍，验证了光学耦合增强机制，为高灵敏度生物传感提供新方案。

　　

蒋家玲|邱南福|杨建宏|张丹晶|林志婉

台湾国立大学生物医学电子与生物信息学研究生院，台北10617

摘要

尽管基于纳米结构的拉曼信号增强策略可以有效提升信号强度，但这些策略通常依赖于复杂的材料合成，并导致基底上结构分布不均匀，从而影响系统稳定性和实际应用性。为了解决这些问题，本研究提出了一种基于Kretschmann配置的表面等离子体共振（SPR）增强拉曼检测平台。通过衰减全反射（ATR）激发表面等离子体极化子（SPPs），并结合SPR的优势（如实时检测、无需标记操作和分子指纹识别），该方法提高了拉曼信号强度和整体检测灵敏度。使用肝素-血小板因子4（PF4）复合物作为目标分析物，验证了该系统的可行性。结果表明，与之前的检测限50 ng/mL相比，该系统的灵敏度显著提高，能够检测到低至1 ng/mL的浓度。此外，对入射角和偏振条件的详细分析表明，在p偏振光照下，SPR共振角处的拉曼信号增强最为明显，从而验证了光耦合增强机制。此外，结合特定拉曼分子特征的多层分析成功识别了制备过程。最终，该系统有望作为传统免疫测定的分析工具，通过增强的拉曼光谱信号识别分子结合相互作用。这不仅为高灵敏度生物传感提供了技术基础，还提高了检测准确性和特异性。

引言

拉曼散射是一种非弹性光散射现象。入射光子与分子之间的能量传递会导致从初始状态到最终状态的转变，从而产生频率位移。它提供了关于分子结构、键合状态和振动模式的信息[1]。与红外光谱相比，拉曼光谱具有更窄的光谱带宽，有助于识别混合组分。它还具有样品制备简单和水干扰小的优点[2]，[3]。然而，拉曼散射事件的概率较低（约10??）和信号强度较弱，限制了其实际应用。为了解决这一挑战，开发了多种增强技术，包括表面增强拉曼散射（SERS）、共振拉曼光谱（RRS）和尖端增强拉曼散射（TERS）[1]，[4]。

大多数SERS研究主要集中在纳米结构设计和材料开发上。通过控制纳米颗粒的形态和大小，可以在纳米尺度上通过光-物质相互作用激发和增强局域表面等离子体共振（LSPR）。它放大了局部电场，促进了热电子的产生，并促进了基底与吸附分子之间的电荷转移，最终提高了拉曼信号强度[5]，[6]，[7]。这些机制分为自发电场和外部电场[8]。例如，Lu等人证明，通过对标准压电材料聚偏二氟乙烯（PVDF）施加不同权重，可以诱导自发电子生成，从而增强银纳米线（AgNWs）周围的局部场[9]。然而，增强程度受到施加权重和施加点与激光束之间距离的限制。另一方面，Almohammed等人开发了一种由氧化石墨烯（GO）和自组装的二苯丙氨酸肽纳米管（FF-PNTs）组成的复合材料[10]。在施加外部电场时，该复合材料表现出显著增强的电荷转移效率。然而，当FF-PNT/GO基底加热到60–100°C或受到超过25 V/mm的电场作用时，热效应降低了增强效果。除了电场诱导的增强方法外，Zheng等人引入了一种多层复合结构，包括核心-卫星纳米颗粒组装、介电二氧化硅（SiO?）层和基于相位调制机制的基底[11]。这种架构实现了强电磁耦合，并通过背面激发和光学干涉的协同效应进一步增强了效果。SiO?层的厚度对信号增强程度起着关键作用。尽管这些方法有望增强拉曼信号，但它们通常依赖于复杂的制备程序，导致基底上纳米颗粒的分布和密度不一致。这些缺点影响了信号的可重复性，并限制了传感的实际应用。

相比之下，通过ATR在光滑金属表面激发的SPPs可以有效增强拉曼信号[12]，[13]，[14]。1988年，Giergiel等人使用Kretschmann配置进行了理论模拟和实验验证[13]。他们确认了信号增强效果，并比较了不同光学设计对响应强度的影响。1997年，Futamata证明，使用Otto配置在不同波长下激发铜酞菁时，其反射率和拉曼带强度都可以显著增强[12]。这种机制具有几个实际优势，包括使用均匀厚度的金属薄膜和简单的制备过程。这些特点提高了电场耦合效率，并通过衰减场的穿透深度便于探测多层化学结构[15]，[16]。然而，这些技术在实际生物检测中的应用仍然相对有限。

SPR是一种光学传感技术，集成了棱镜耦合、薄金属层和介电层。它具有无需标记检测、实时监测、动力学分析以及简化流体处理和清洗程序等优点。因此，SPR已广泛应用于抗原识别、浓度定量和分子亲和力研究等领域[17]，[18]，[19]。当p偏振光通过高折射率棱镜以超过临界角照射金属表面时，反射率逐渐降低，在共振角附近接近零。然后在更大的入射角下恢复到接近最大水平。在这些条件下，反射光的强度急剧下降，部分能量不仅以衰减波的形式穿透较不密集的介电介质，还沿表面横向传播。衰减场在金属层内诱导自由电子的振荡，生成金属-介电界面处的表面等离子体波（SPWs）[20]。产生的电场沿水平轴传播，并随着与金属-介电界面的垂直距离增加而呈指数衰减。穿透深度定义为场强度降至其最大值的1/e（约37%）的距离。这个深度通常在几百纳米（200–400 nm）范围内，取决于入射波长、金属层等，足以监测表面附近的生物分子相互作用。当发生相互作用时，有效折射率的变化会改变SPWs的传播特性。相应地，入射光的平面波矢（k?）必须与SPW的平面波矢（k???）相匹配[21]，[22]。用于SPR的金属包括银（Ag）、铜（Cu）、铝（Al）和金（Au）[23]，[24]。其中，金由于其优异的化学稳定性和抗氧化性而被最广泛使用，尽管其成本相对较高。SPR系统通常分为两种配置：Otto和Kretschmann[25]，[26]。Kretschmann配置通过棱镜耦合在金属-介电界面激发SPWs，具有简单的设置和高重复性。与需要精确控制棱镜与金属膜之间间隙的Otto配置不同，Kretschmann配置在实验上更易实现，因此被最广泛采用。此外，它支持多种检测模式，包括角度、波长、强度和相位调制[27]，[28]。图1

本研究旨在验证SPR–Raman系统在纳摩尔浓度下检测微量生物样本的可行性和检测能力。因此，选择了临床相关的肝素–PF4复合物作为代表性例子。该复合物的形成是肝素诱导的血小板减少症（HIT）发展中的一个关键步骤[29]，[30]。研究表明，大约三分之一的HIT患者会出现血栓并发症，在严重情况下，相关死亡率可达20–30%[29]。此外，当前的临床检测方法依赖于耗时的ELISA或放射性免疫测定，这些方法需要多步骤程序和专门的实验室设施，且无法提供实时动力学信息[29]，[31]，[32]。相比之下，SPR可以实现分子结合事件的实时监测，而拉曼光谱提供了分子级别的光谱识别。因此，结合这些技术提供了一种更具特征性的检测方法，用于分析生物分子相互作用，支持开发高灵敏度生物传感平台。

多功能SPR–Raman系统设置

在SPR光学设置中，入射波长设置为690 nm，以与商用BI-3000 SPR仪器（Biosensing Instrument，美国）保持一致。平凸透镜将激光束准直为平行光束，然后通过光圈调整以确保均匀照明。偏振器生成p偏振光以在金-介电界面激发SPWs。在到达BK7棱镜（n = 1.52）之前，光束通过另一个透镜聚焦到金表面

多功能SPR–Raman系统的验证

图5(a)显示，在固定入射波长690 nm的情况下，依次测量了不同折射率的介质，包括DI水（n = 1.3300）、1× PBS（n = 1.3347）、80 g/L葡萄糖溶液（n = 1.3427）和99%乙醇（n = 1.3592）。这些介质的实验测量SPR角度分别为73.325°、74.450°、75.375°和79.000°。接下来，根据图5(b)中显示的回归曲线（该曲线将测量的SPR角度与折射率相关联），

结论

总之，本研究结合了SPR和拉曼光谱（使用Kretschmann配置），证明了其在检测肝素–PF4复合物方面的适用性。初步的乙醇验证显示，信号增强了约4倍，与之前的研究结果一致。随后，穿透深度模拟确认目标生物分子位于有效感应区域内。尽管目标层仅占感应深度的约10%，但SPPs诱导的增强效果仍然显著

CRediT作者贡献声明

林志婉：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、方法学、正式分析、概念化。蒋家玲：撰写 – 原始草稿、可视化、验证、方法学、调查、正式分析。杨建宏：撰写 – 原始草稿、方法学、数据管理。邱南福：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、方法学、概念化。张丹晶：撰写 – 原始草稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了台湾科技部的支持，资助项目编号为MOST 111-2221-E-002-079-MY3。

蒋家玲：蒋家玲于2021年在中原基督教大学获得生物医学工程学士学位，2023年在台湾国立大学（NTU）获得硕士学位，期间在林志婉教授和邱南福教授的指导下进行了SPR增强拉曼光谱的研究。她目前正在NTU的生物医学电子与生物信息学研究生院攻读博士学位，得到教育部的博士培养支持